二月蘭對銅污染的耐受與富集分析

姜勝行， 劉一博， 李威， 鄭思， 明鳳，*

二月蘭對銅污染的耐受與富集分析

姜勝行1?， 劉一博2?， 李威1， 鄭思2， 明鳳1，*

（1.上海師范大學 生命科學學院，上海 200234； 2.上海中學，上海 200237）

為探究十字花科植物二月蘭對土壤中銅離子的吸收和耐受性，采用不同濃度的硫酸銅溶液對其種子萌發階段和生長階段進行處理，測定了二月蘭的生理指標.結果表明：銅離子溶液處理15 d后會對二月蘭的萌發率產生影響.當銅離子質量分數為35，100 mg?kg-1時，均能促進二月蘭種子的萌發，而400 mg?kg-1處理組則導致萌發率顯著下降，發芽率僅為對照組的41％；土壤栽培處理，35，100 mg?kg-1均能促進二月蘭生長，而400 mg?kg-1處理組則導致生長幅度減小，葉片數量和株高也顯著少于前兩組實驗.同時，400 mg?kg-1處理組導致超氧化物歧化酶（SOD）和過氧化物酶（POD）的活性提高，銅離子對二月蘭造成一定生長脅迫.銅離子轉運系數和富集系數分別為0.56和0.52，說明二月蘭對銅離子的富集能力表現優良，尚未造成毒害.進一步分析銅離子轉運相關基因的表達，外源施加銅離子，導致體內基因表達量相對于對照組顯著降低. 本研究揭示了二月蘭對于土壤中銅離子污染具有吸收和富集作用，為治理土壤中銅離子污染提供了理論依據，并證明二月蘭可作為優良的富集植物.

二月蘭； 銅離子脅迫； 富集； 生理指標分析

0 引 言

2014年國家環保部與國土資源部發布信息顯示，我國的土壤無機污染物超標達82.8％，其中銅離子污染占比2.1％［1］.據調查，長三角地區超過10％的農田幾乎失去了種植作物的能力［2］.對南京市江寧鄉某地的調查顯示：重金屬含量在局部地區已經到達警戒范圍［3］，其中華東長三角地區的老礦業區、工業區的土壤重金屬離子污染嚴重，許多廢棄礦業區已經不適合植物的生長.銅離子的毒害性很強，攝入過量會導致植物體紊亂，使植物出現萎蔫等狀態，影響其生長發育及產量［4］.它的毒性還與癌癥、神經退行性疾病有關聯，通過食物鏈進入人體后還會危害人類健康［5］.另外，過量的銅離子攝入還會導致細胞破裂和死亡，影響機體代謝［6］.

對于土壤中重金屬離子的治理方法目前主要分為4類：物理、化學、生物和生物技術方法［7］.其中生物修復土壤污染方法包括動物修復、微生物修復和植物修復［8］.植物修復法，即選用富集能力強的植物來吸收土壤中對應的重金屬，這樣不僅不會破壞生態環境，且治理成本也低，是目前最具應用前景的方法. 目前對于超富集植物的篩選和判斷標準已經趨于成熟，主要通過轉運系數、富集系數以及地上部分積累值標準三方面進行綜合判斷.有研究證明種植苧麻、圓葉遏藍菜等植物可富集土壤中的重金屬，從而改善土壤環境［9］.植物修復法目前的難點在于植物生長周期長，導致治理效率低下；另一方面，耐金屬的植物品種仍然不多，導致種植密度并不理想.因此，探究和篩選出生長周期短、富集污染物效率高的植物是生態學者們的研究熱點.

諸葛菜（）屬十字花科，別名二月蘭，是1年或2年生的草本植物，在農歷二月前后開花，花瓣呈藍紫色或淡紅色，常被作為林下種植植物.其適應性、耐寒性強，對土壤的要求不高，即使在寒冷的冬季也依舊可以保持郁郁蔥蔥.本研究選取二月蘭作為目標植物，在不同濃度銅離子溶液處理下，對其萌發率、葉片數和株高進行了觀測，通過測量葉片相對電導率了解植物膜系統狀況，通過二氨基聯苯胺（DAB）、氯化硝基四氮唑藍（NBT）染色法揭示二月蘭葉片活性氧代謝程度等生長過程中的相關生理生化指標，并測定最終的銅離子轉運系數和富集系數，為二月蘭作為能富集銅離子的功能性觀賞植物的可能提供了理論參考.

1 材料與方法

1.1　材料與試劑

植物材料為二月蘭種子（綠景園種業，江蘇宿遷）；生化試劑包括硫酸銅、NBT、DAB、甘油.

1.2　儀器與設備

分析天平、直尺、電導儀、熒光定量聚合酶鏈式反應（PCR）儀器、玻璃平皿、10 mL注射器；FR-250系列電泳儀，上海復日科技有限公司；GenoSens 1850凝膠成像儀，上海勤翔科學儀器有限公司；Biometra Tone 96G PCR反應儀，德國Biometra GmbH/Analytik Jena AG.

1.3　方 法

1.3.1實驗分組及處理

本實驗選取常規的二月蘭種子，在加入不同濃度梯度硫酸銅溶液的玻璃皿中生長，為了溶液分布均勻，將滅菌的濾紙覆蓋在平皿上，種子均勻播撒.

表1　硫酸銅熔液配方

實驗設計4個處理組（表1），以去離子水為對照（CK）種子播撒完成后，用封口膜將玻璃皿封住，每個處理組梯度重復3個，于恒溫25 ℃培養室內培養，每3 d加一次處理液.

種子萌發后進行萌發率測定，并將萌發的種子移栽至配置好的營養土中進行生長.此后，每3 d進行一次處理，加入等量不同濃度的硫酸銅溶液.

1.3.2理化指標的測定

1） 二月蘭葉片數及生長高度的測量：培養期間，每7 d使用直尺，于下午5時測定每棵幼苗的高度和葉片數.

2） 葉片相對電導率采用抽氣法測定：用打孔器取3片大小一致的二月蘭葉片作為一組，每個樣品重復3組，加入10 mL雙蒸水（dd H2O）抽真空，使葉片全部浸沒在水中；搖床輕搖4 h，用電導率儀測量煮前電導率1；沸水浴20 min，冷卻至室溫后，測量煮后電導率2.相對電導率為1/2×100%.

3） 過氧化物酶（POD）和超氧化物歧化酶（SOD）活性檢測：POD活性采用DAB染色法測定，SOD 活性采用NBT染色法測定.在各硫酸銅溶液濃度梯度處理的樣品中隨機取3片葉片，加入各自染液，沸水浴加熱5 min，暗處靜置16 h染色，倒出染液，用清水沖洗樣品2～3次，加入無水乙醇，水浴加熱5 min，倒去乙醇，重復至脫色，加入甘油溶液（體積分數為40%）保存，暗處靜置2 h，取出葉片樣品，吸干甘油后進行觀察.

4） 葉綠素含量檢測：將二月蘭葉片稱取同等的0.3 g，浸沒在提取液（體積分數70%丙酮+20%乙醇+10%水）中，4 ℃輕搖過夜，利用分光光度計分別在663 nm和645 nm下，測定吸光度663和645，葉綠素質量濃度（單位mg?L-1）測定方法為：

Chla=12.7663-2.69645，

Chlb=22.9645-4.68663，

Chl=Chla+Chlb=20.21645+8.02663，

其中，Chla，Chlb，Chl分別為葉綠素a、葉綠素b和葉綠素的質量濃度.

表2　qPCR引物

5） 植物銅離子結合相關基因（）實時熒光定量聚合酶鏈式反應（qPCR）測定：取各樣品葉片，用艾科瑞生物公司的植物RNA提取試劑盒提RNA，定量反轉錄cDNA，根據擬南芥同源基因設計定量引物和內參基因引物（actin），各設計3對引物進行點樣qPCR，分析qPCR數據.選取引物如表2所示.

1.3.3數據處理

用Excel進行數據整理與分析，用Graphpad Prism9制圖，采用Student’s-test進行單因素方差分析.

2 結果分析

2.1　不同濃度銅離子溶液對二月蘭萌發率的影響

將采購的種子在含不同濃度銅離子溶液的玻璃皿中培養，培養期間每3 d補一次溶液，并在第15天拍照（圖1（a）～1（d））和測定萌發率（圖1（e）～1（f））.

圖1　不同濃度銅離子處理組對二月蘭萌發率的影響.

（a） CK，（b） 一級、（c） 二級、（d） 三級銅離子處理15 d的種子萌發照片；（e） 15 d統計發芽率；（f） 萌發率對比柱狀圖（**表示極顯著差異<0.01，=100）

與CK對比，加入不同濃度銅離子溶液處理的二月蘭種子萌發率差異很大，一級處理后對萌發效果促進最好，萌發率達70％；二級處理對二月蘭的萌發也有促進；三級對萌發效果抑制最明顯，萌發率只有23.3％（圖1（e），1（f））.該結果表明：銅離子質量分數在35～100 mg?kg-1之間時，對二月蘭的萌發有促進效果，而達到400 mg?kg-1時會抑制二月蘭種子的萌發.

2.2　不同濃度銅離子溶液對二月蘭生長狀況的影響

二月蘭進行盆栽培養，35 d后觀察各處理組二月蘭株系生長情況（圖2）.與CK相比，銅處理7 d后二月蘭長勢顯著變慢，第21天開始三級處理組出現死亡.而二級處理組在7 d后就有顯著促進生長現象，這與種子萌發結果相似.隨著時間的增長，二級處理組的長勢要高于CK，而CK又顯著高于三級處理組.

圖2　不同濃度銅離子處理組對二月蘭生長狀況的影響.

（a） 0 d；（b） 7 d；（c） 14 d；（d） 21 d；（e） 28 d；（f） 35 d

土壤栽培期間，進行生長期各處理組株系的株高、葉片數、葉片狀態、死亡率指標測定（圖3）.隨著種植時間的延長，二級處理組的葉片數以及狀態與株高均高于三級處理組（圖3（a），3（b），3（d）），且高于CK.而只有三級處理死亡率為16.7％，遠高于CK和二級處理組（圖3（c）），說明三級處理組對于銅離子的耐受性低.實驗結果表明：適量濃度的銅離子可以促進二月蘭生長，而濃度過高又會顯著抑制二月蘭生長.

圖3　不同處理時間進行（a） 葉片數、（b） 株高的統計及處理30 d后的（c） 死亡率及（d） 單株葉片數取樣觀察（*代表顯著差異p<0.05，n=6）

2.3　二月蘭生長過程中活性氧代謝和相關指標的鑒定

葉綠素含量與植物生長狀態成正比，通過檢測土壤中生長35 d后的二月蘭葉綠素含量，可知二級處理組葉綠素含量最高，CK含量最低，而三級處理組介于兩者之間（圖4（a）），說明銅處理并沒有抑制二月蘭體內葉綠素的合成.在逆境之下植物膜系統會損傷，細胞液外流，因此相對電導率能夠反映植物體內膜系統的狀況.本實驗中，三級處理組相對電導率增加，而二級處理組幾乎與CK無差別，綜合實驗結果可知：三級處理組雖然受到銅離子脅迫嚴重，但相對電導率略有增加，說明細胞膜系統受損較輕，能在吸收和富集銅離子的過程中起作用（圖4（b））.采用DAB和NBT染液進行染色，驗證POD與SOD的積累，過氧化氫可以直接或間接地反映植物細胞受到損害的程度，植物細胞受到損害越嚴重，DAB染色后棕色物質積累越多.本實驗中葉片細胞受損最嚴重的是三級處理組，其次是二級處理組，CK組無損傷（圖4（c）），表明在二級和三級兩個不同銅離子濃度處理下，葉片中POD的活性降低.另外，SOD可清除植物體內O2-的積累，經過NBT染色后，樣品顏色呈現藍色越明顯，則說明酶活性越低.三級處理組的葉片邊緣有些許藍色累積（圖4（d）），而二級和CK都沒有藍色累積，說明三級處理導致SOD些許積累.研究表明：經過不同濃度梯度銅離子處理后，高濃度處理會對二月蘭葉片造成些許損傷，但整體影響不大，進一步說明二月蘭可以在對銅離子的吸收和富集過程中起作用.

圖4　銅離子脅迫處理后二月蘭葉片相關指標測量.

（a） 葉綠素含量；（b） 相對電導率；（c） DAB染色；（d） NBT染色（*<0.05，**<0.01，=3）

2.4　二月蘭耐受銅離子脅迫的機理探究

在用銅離子溶液處理85 d后（圖5），相比二級處理組，三級處理組的生長狀況明顯較差，且死亡率達到50%，說明高濃度銅處理對二月蘭的傷害性最強.

圖5　處理85 d植株表型整體觀.（a） CK；（b） 二級；（c） 三級

用銅離子溶液處理85 d后，3個實驗組都改用自來水灌溉，繼續培養15 d，最后對二月蘭植株進行取樣，測定各類指標和含量（圖6）.由圖6（b）可知，根系質量隨著銅離子濃度的增加而減少；根系長度在二級有所增加，但三級又減少；株高也隨濃度增加有比較明顯的降低趨勢.

圖6　培養100 d后根部表型以及指標分析.

（a） 根系表型；（b） 根系質量；（c） 根系長度；（d） 株高（*<0.05，**<0.01，***<0.001，=3）

二月蘭中的序列與擬南芥中基本一致，因此利用其進行表達量測定.與CK相比，二級和三級處理組的表達量大幅度下降，差異顯著，說明施加銅離子溶液之后，二月蘭體內的COPT1蛋白對Cu+進行了轉運.對二月蘭的地下和土壤兩部分進行銅離子含量的檢測（圖7（a），7（b））可以看出各處理組地下部分銅離子含量遠高于CK，而施加更高濃度的三級處理組土壤中的銅離子含量與二級處理組含量無顯著差異，說明二月蘭對銅離子的吸收和富集能力有優勢，且在高濃度的情況下吸收效果更好. 三級處理組對銅離子轉運系數和富集系數分別為0.22和0.52（CK處理組分別為0.17和0.56），說明對銅離子的富集濃度隨外源銅離子處理濃度增加而增加，污染濃度達到國家標準三級時滿足重金屬富集優良植物標準.這些結果也進一步說明二月蘭植株可以作為吸收和富集銅離子的優良品種.

圖7　培養100 d后二月蘭中銅含量測定以及相關系數分析.

（a） 根部；（b） 地上部分；（c）的相對表達量（*<0.05，**<0.01，***<0.001，=3）

3 討 論

銅離子過量對植物生長有顯著的抑制作用，根系質量則隨濃度增加而減輕.由于銅離子屬于無機鹽微量元素的一種，植株適量吸收接觸銅離子后，其會參與協助植株體內各項機理，或會促進植物生長素的分泌，對營養成分的吸收利用等其他生化過程有所幫助，根系長度的增加證明了這一點.研究中還發現，葉綠素含量在銅離子脅迫下均相較CK有所上升.少量的銅離子可以促進植物體內相關酶的合成，促進植物生長，可能是部分銅離子轉運到葉片中，促進了葉綠素相關合成酶的表達，從而導致葉綠素含量上升［10］.

擬南芥COPT1基因主要在根尖等部位表達，對Cu+具有較高親和力，當Cu2+被ZIP蛋白吸收或被FRO還原為Cu+時，Cu+通過COPT1蛋白轉運進入細胞質，且其表達受Cu負調控［11］，擬南芥和二月蘭同為十字花科植物，且二月蘭沒有基因組.利用擬南芥中COPT1和actin作為模板設計定量引物并送測序，發現二月蘭中的序列與擬南芥中一致，因此使用其引物進行定量檢測，結果與之前的研究一致，在處理組中的表達量顯著降低（圖7（c）），說明二月蘭對土壤中的銅離子進行了富集和吸收.對于二月蘭富集特性，可能與COPT1基因表達下調有關，具體分子機理需要深入研究.

在生長過程中，二月蘭植株生長狀況和抗病能力也隨之減弱，尤其是二級處理組，由于病蟲害問題，導致地上部分萎蔫，所以在測定銅離子轉運系數和富集系數時，只做了CK和三級處理組的地上部分. 也許是二級處理植物富集一定的銅離子而影響其免疫能力，這一點值得進一步探究.結果證明：二月蘭在銅離子濃度達到國家三級標準時能夠起到富集作用，但其生長狀況也受到較大影響.而在一級、二級標準下生長萌發情況較好，可以與其他超富集植物混種，或用作污染土地造景植物，美化城市環境.

4 結 論

本實驗以國家不同標準濃度的銅離子溶液為處理劑，對二月蘭進行處理，觀察分析了二月蘭各項生長指標，證明二月蘭對銅離子吸收和富集作用顯著.二月蘭在國家三級污染標準下（400 mg?kg-1）對銅離子的富集系數和轉運系數分別為0.22和0.52，說明二月蘭可作為優良富集植物對土壤中的重金屬污染物進行富集.

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Analysis of the tolerance and enrichment of copper pollution in

JIANGShenghang1?， LIUYibo2?， LIWei1， ZHENGSi2， MINGFeng1*

（1.College of Life Sciences， Shanghai Normal University， Shanghai 200234， China； 2.Shanghai High School， Shanghai 200237， China）

In order to explore the absorption and tolerance of the bronze ions of Cruciferous plantin the soil，the copper chloride solutions with different concentration gradients are treated on the’s seeds and its plantlets during different development phases，and the physiological indexes ofwere determined. The results showed that after 15 d of different concentration copper ion solutions，the germination rate ofwas affected. The mass fraction of copper ion 35，100 mg?kg-1can promote the germination ofrespectively，while the 400 mg?kg-1treatment group leads to a significant decrease in germination rate，the germination rate is only 41% of the control group. Soil cultivation treatment for35，100 mg?kg-1can promote their growth，while 400 mg?kg-1treatment group leads to decline in growth. And the number of blades and plants are also significantly less than the first two experimental groups. At the same time，the 400 mg?kg-1treatment group caused the activity of superoxide dismutase（SOD） and peroxidase （POD） increased，thus copper ions caused certain growth stress on. The copper ion transport coefficient and the enrichment coefficient are 0.56 and 0.52，respectively，indicating that the enrichment of copper ions on copper ions is excellent，and has not been poisoned. Further analysis of the expression of copper ion transshipment related genes，exogenous application of copper ions，resulting in significant decreasesgene expression relative to the control group. This study revealed that thehas abilities of absorption and enrichment on the copper ion pollutions in soil，which providing theoretical basis for the removing copper ion pollutions from soil and the recommendation guiding significance of enriching plants.

； copper ion stress； enrichment； analysis of physiological indicators

10.3969/J.ISSN.1000-5137.2022.04.013

2021-11-23

上海市地方院校能力建設專項項目（20070502500）； 上海植物種質資源工程技術研究中心項目（17DZ2252700）

姜勝行（1996—）， 男， 碩士研究生， 主要從事植物學方面的研究. E-mail： jiangshenghangzjd@163.com

明 鳳（1971—）， 女， 教授， 主要從事植物非生物逆境遺傳學方面的研究. E-mail： fming@fudan.edu.cn

姜勝行， 劉一博， 李威， 等. 二月蘭對銅污染的耐受與富集分析 ［J］. 上海師范大學學報（自然科學版），2022，51（4）：483?491.

JIANG S H， LIU Y B， LI W， et al. Analysis of the tolerance and enrichment of copper pollution in［J］. Journal of Shanghai Normal University（Natural Sciences）， 2022，51（4）：483?491.

Q 945

A

1000-5137（2022）04-0483-09

劉一博提出研究思路， 姜勝行設計研究方案， 姜勝行、 劉一博共同進行實驗， 共同撰寫論文； 姜勝行完成文章整理與修改.二人共同完成本論文， 因此并列為第一作者.

（責任編輯：顧浩然）