外源添加L-蘋(píng)果酸降低秀麗隱桿線蟲(chóng)體內(nèi)脂肪含量

機(jī)體中，L-蘋(píng)果酸參與蘋(píng)果酸天冬氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程，具有轉(zhuǎn)移還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸、還原型輔酶I(NADH)的作用

。此外,L-蘋(píng)果酸對(duì)機(jī)體有較多有益的生理功能，如運(yùn)動(dòng)過(guò)程中降低血清肌酸激酶水平，減少骼肌損傷

；減少脂質(zhì)過(guò)氧化增強(qiáng)機(jī)體抗氧化能力

；預(yù)防老年性癡呆等

。L-蘋(píng)果酸作為低熱量的酸味食品添加劑廣泛應(yīng)用于各類食品等的生產(chǎn)加工，可保持食品的口感和色澤

。秀麗隱桿線蟲(chóng)作為一種實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｊ缴铮子谂囵B(yǎng)、遺傳操作簡(jiǎn)單，通體透明便于觀察。更重要的是，哺乳動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)的許多核心代謝通路在線蟲(chóng)中相當(dāng)保守，包括脂肪酸合成、延伸、去飽和和β-氧化，以及神經(jīng)肽、5 -羥色胺和胰島素信號(hào)通路等。本研究通過(guò)外源添加L-蘋(píng)果酸探索其在秀麗隱桿線蟲(chóng)脂代謝過(guò)程中的作用和機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

L-蘋(píng)果酸，上海生工生物工程有限公司；RNA提取試劑盒、c-DNA合成試劑盒，天根生化科技(北京)有限公司；qPCR引物，由上海生工生物工程有限公司合成；SYBR Green，北京聚合美生物科技有限公司；尼羅紅、油紅染料，美國(guó)Sigma-Aldrich公司；

-6：GFP和

-7：GFP線蟲(chóng)，由云南生物資源保護(hù)與利用國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室饋贈(zèng)。

1.2 儀器與設(shè)備

倒置熒光顯微鏡，日本Nikon公司；超聲破碎儀，寧波新芝生物科技公司；酶標(biāo)儀，美國(guó)BioTek儀器有限公司；PCR儀，德國(guó)Biometra公司；電泳儀、凝膠成像系統(tǒng)，美國(guó)Bio-Rad公司；實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀，德國(guó)Eppendorf公司；低溫高速離心機(jī)，美國(guó)貝克曼公司；震蕩儀，海門市其林貝爾儀器制造有限公司；旋渦混合器，北京金紫光科技發(fā)展有限公司。

由表8可知隨著染色溫度的增加，棉條表觀深度K/S值提高，但溫度超過(guò)70℃以后，K/S值減小。這是由于溫度升高，染料加速擴(kuò)散，上染速率提高，同時(shí)染料水解速率提高，但在一定的溫度范圍內(nèi)，溫度提高，染料上染速率大于水解速率，但是當(dāng)超過(guò)合適溫度時(shí)，染料的水解速率大于上染速率，所以上染率降低，棉條得色淺，因此選擇染色溫度70℃為宜。

1.3 方法

1.3.1 秀麗隱桿線蟲(chóng)培養(yǎng) 使用大腸桿菌OP50菌株作為食物源，將其均勻涂于線蟲(chóng)生長(zhǎng)的培養(yǎng)基(NGM)上。將同步化后的800～1 000條左右的L1的線蟲(chóng)接種于涂布了OP50的NGM平板上，20 ℃培養(yǎng)2 d至產(chǎn)1～3顆卵的成蟲(chóng)期備用。

1.3.7 qPCR分析 收集L4期線蟲(chóng)，按寶生物工程(大連)有限公司的RNA提取試劑盒的步驟提取線蟲(chóng)的總RNA，并測(cè)定其含量。按天根生化科技有限公司的逆轉(zhuǎn)錄試劑盒步驟來(lái)合成cDNA，反應(yīng)體系：SYBR green mix 10 μL、上游引物0.5 μL、下游引物0.5 μL、cDNA 2 μL、ddH

O 10 μL，使用羅氏熒光定量PCR儀進(jìn)行定量。我們以

-1為內(nèi)參基因，用2

計(jì)算基因轉(zhuǎn)錄水平差異，引物序列見(jiàn)附表。

1.3.3 油紅O(ORO)染色 500 mg ORO粉溶于100 mL異丙醇，制成母液避光密封保存?zhèn)溆谩Ｊ褂们耙匀ルx子水按3∶2比例稀釋異丙醇油紅O母液，震蕩2 h使其充分溶解，用0.2 μm微孔濾膜過(guò)濾雜質(zhì)制備為工作液，錫箔紙包裹避光冰箱儲(chǔ)存?zhèn)溆谩Ｒ訮BST(含0.01% Triton)將攜帶1～3個(gè)蟲(chóng)卵的成蟲(chóng)輕洗于1.5 mL離心管中，反復(fù)清洗3次至澄清狀態(tài)無(wú)菌。以560 g離心1 min去掉上清，留100 μL重懸，加入600 μL 40%異丙醇在室溫下震蕩孵育3 min，560 g離心1 min，去上清，留100 μL重懸。加入600 μL ORO工作液混勻，將樣品在室溫下避光旋轉(zhuǎn)孵育2 h，560 g 離心1 min，去上清留100 μL。加入600 μL PBST重懸，在避光條件下旋轉(zhuǎn)孵育30 min去除多余ORO染色劑，560 g離心1 min，留50 μL上清液。取15 μL線蟲(chóng)懸浮液置于載玻片上，相同曝光時(shí)間進(jìn)行白光拍照。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，每個(gè)組拍攝不少于20條。

3.2.5 避免生理鹽水沖洗氣管插管 生理鹽水滴注到氣管插管造成管壁生物膜沖入肺內(nèi)，易形成感染。研究認(rèn)為，生理鹽水沖洗氣管插管沒(méi)有起到稀釋痰液的作用，反而使肺的氧合下降，血壓及心率增快，顱內(nèi)壓增高及發(fā)生VAP風(fēng)險(xiǎn)增大［47］。

ECDSA是數(shù)字簽名算法（DSA）的其中一個(gè)例子。和非對(duì)稱加密算法（RSA）進(jìn)行對(duì)比，在相同的安全強(qiáng)度下，ECDSA可以使用的密鑰更短，從而節(jié)省網(wǎng)絡(luò)和存儲(chǔ)空間，具有較高的研究?jī)r(jià)值[5]。

秀麗隱桿線蟲(chóng)體脂主要儲(chǔ)存于腸上皮細(xì)胞和腸道中，ORO和NR染色法能客觀地展示秀麗隱桿線蟲(chóng)體內(nèi)脂肪

。采用ORO染色、NR染色和TG含量測(cè)定3種方法對(duì)線蟲(chóng)體內(nèi)脂肪進(jìn)行分析。將同步化后500條左右L1線蟲(chóng)分別加至含L-蘋(píng)果酸0、200、500、1 000 μg/mL的NGM平板，培養(yǎng)至攜帶1～3個(gè)蟲(chóng)卵的成蟲(chóng)，進(jìn)行ORO染色和NR染色。其中NR染色表明，與對(duì)照組(0 μg/mL)相比，200、500、1 000 μg/mL L-蘋(píng)果酸喂養(yǎng)線蟲(chóng)脂肪顆粒數(shù)量減少(圖1A)；脂肪顆粒體積減小(圖1A)，由1.66 μm分別減小至1.43、1.17、1.05 μm(圖1C)(

<0.05)。ORO染色表明，與對(duì)照組(0 μg/mL)相比，200、500、1 000 μg/mL L-蘋(píng)果酸喂養(yǎng)線蟲(chóng)脂肪含量分別降至83.33%、87.67%、76.67%(圖1B、D)(

<0.05)。同時(shí)，根據(jù)TG含量的測(cè)量結(jié)果，與對(duì)照組(0 μg/mL)相比，200 、500 、1 000 μg/mL L-蘋(píng)果酸喂養(yǎng)線蟲(chóng)TG含量分別降至0.49、0.61、0.82倍(圖1E)(

<0.05)。綜上所述，外源添加200、500、1 000 μg/mL L-蘋(píng)果酸喂養(yǎng)線蟲(chóng)，脂肪顆粒的數(shù)量減少、體積減小，降低體內(nèi)脂肪含量。

1.3.2 脂肪酸測(cè)定 培養(yǎng)線蟲(chóng)至產(chǎn)1～3顆卵的成蟲(chóng)期，用單蒸水洗脫5～10個(gè)培養(yǎng)皿的線蟲(chóng)至8 mL GC專用玻璃管中，置于冰上沉淀。單蒸水清洗2次，待蟲(chóng)體沉淀后去除上清。液氮速凍保存于-80 ℃冰箱。加入1 mL酯化液，70 ℃水浴鍋酯化1～2 h，冷卻后加入1.5 mL雙蒸水和200 μL正己烷，劇烈震蕩。4 000 r/min離心2 min后分2層，上層有機(jī)相為酯化脂肪酸。取上層有機(jī)相80 μL置于GC玻璃瓶中(加入襯管)，上機(jī)檢測(cè)

。

外源添加L-蘋(píng)果酸降低了C16：1n-7/C16：0和C18：1n-9/C18：0的比值，硬脂酰輔酶a去飽和酶(SCD)是將棕櫚酸C16：0和硬脂酸C18：0分別轉(zhuǎn)化為棕櫚油酸C16：1n-7和油酸C18：1n-9的關(guān)鍵酶

，接下來(lái)檢測(cè)L-蘋(píng)果酸對(duì)線蟲(chóng)3個(gè)SCD基因

-5、

-6、

-7的影響。qPCR結(jié)果顯示，與對(duì)照組(0 μg/mL)相比，200、500、1 000 μg/mL L-蘋(píng)果酸飼養(yǎng)線蟲(chóng)，

-5基因mRNA相對(duì)水平分別下調(diào)為0.71、0.59、0.46倍(

<0.05)(圖3)；

-6基因mRNA相對(duì)水平分別下調(diào)為0.79、0.64、0.57倍(

<0.05)(圖3)；

-7基因mRNA相對(duì)水平分別下調(diào)為0.84、0.69、0.63倍(

<0.05)(圖3)。此外，檢測(cè)了L-蘋(píng)果酸對(duì)SCD基因轉(zhuǎn)錄因子

-1的影響，與對(duì)照組(0 μg/mL)相比，200 、500、1 000 μg/mL L-蘋(píng)果酸飼養(yǎng)線蟲(chóng)

-1 基因mRNA相對(duì)水平分別下調(diào)為0.74、0.62、0.50倍(

<0.05)(圖3)，表明L-蘋(píng)果酸抑制轉(zhuǎn)錄因子

-1的表達(dá)，從而下調(diào)

-5、

-6和

-7基因的轉(zhuǎn)錄。

2 結(jié)果與討論

2.1 外源添加L-蘋(píng)果酸可減少秀麗隱桿線蟲(chóng)體內(nèi)脂肪含量

1.3.6 FAT-6：GFP和FAT-7：GFP熒光強(qiáng)度觀察 將同步化后孵化的

-6：GFP、

-7：GFP L1線蟲(chóng)轉(zhuǎn)移至含L-蘋(píng)果酸0、200、500、1 000 μg/mL 的NGM培養(yǎng)皿中，在標(biāo)準(zhǔn)條件下培養(yǎng)至攜帶1～3個(gè)蟲(chóng)卵的成蟲(chóng)。M9洗下后吸取15 μL制片，在熒光顯微鏡下使用FITC/GFP通道觀察。

2.2 外源添加L-蘋(píng)果酸對(duì)脂肪酸含量的影響

將同步化后500條左右L1線蟲(chóng)分別加至含L-蘋(píng)果酸0、200、500 μg/mL的培養(yǎng)基中培養(yǎng)線蟲(chóng)至攜帶1-3個(gè)蟲(chóng)卵的成蟲(chóng)，分別收集5-10個(gè)培養(yǎng)皿的線蟲(chóng)測(cè)定各類脂肪酸含量。與對(duì)照組(0 μg/mL)相比，200 μg/mL L-蘋(píng)果酸飼養(yǎng)線蟲(chóng)后，脂肪酸含量C15 iso由3.42%降至2.8%、C17 iso由5.5%降至4.29%、C20：5n-3由17.00%降至9.77%(

<0.05)，脂肪酸含量C16：0由3.4%增至4%、C17 Δ由6.13%增至7.23%、C19 Δ含量由8.10%增至8.59%(

<0.05)，脂肪酸含量C14：0由0.95%變?yōu)?.92%、C16：1n-7由3.47%變?yōu)?.44%、C17：0由1.24%變?yōu)?.45%、C18：0由5.56%變?yōu)?.94%、C18：1n-9由2.66%變?yōu)?.00%、C18：1n-7由25.96%變?yōu)?0.23%、C18：2n-6由5.34%變?yōu)?.35%、C18：3n-6由1.88%變?yōu)?.02%、C20：3n-6由3.17%變?yōu)?.12%、C20：4n-6由1.64%變?yōu)?.62%、C20：4n-3由4.44%變?yōu)?.20%，含量無(wú)明顯變化(

>0.05)(圖2)。500 μg/mL L-蘋(píng)果酸喂養(yǎng)線蟲(chóng)后，C15 iso由3.42%降至2.40%、C16：1n-7由3.48%降至2.28%、C17 iso由5.50%降至3.83%、C18：2n-6由5.35%降至4.62%、C18：1n-9由2.66%降至1.53%、C20：4n-6由1.62%降至1.15%、C20：4n-3由4.44%降至3.81%、C20：5n-3由17.00%降至13.55%(

<0.05)，脂肪酸C17 Δ由6.13%增至11.85%、C18：0由5.67%增至6.37%、C19 Δ由8.10%增至9.83%(

<0.05)，脂肪酸C14：0由0.95%變?yōu)?.94%、C16：0由3.40%變?yōu)?.50%、C17：0由1.24%變?yōu)?.51%、C18：1n-7由25.96%變?yōu)?8.51%、C18：3n-6由1.88%變?yōu)?.05%、C20：3n-6由3.17%變?yōu)?.88%，含量無(wú)明顯變化(

>0.05)(圖2A-C)。此外，與對(duì)照組(0 μg/mL)相比，200、500 μg/mL L-蘋(píng)果酸喂養(yǎng)線蟲(chóng)后C16：1n-7/C16：0由1.02降至0.86和0.65(

<0.05)(圖2D)；C18：1n-9/C18：0的比例由0.47變?yōu)?.50(

>0.05)和0.24(

<0.05)，C16：1n-7/C16：0和C18：1n-9/C18：0比例降低。脂肪中的單不飽和脂肪酸棕櫚油酸C16：1n-7和油酸C18：1n-9是生物合成甘油三酯、磷脂、膽固醇酯等的重要底物。C16：1n-7/C16：0和C18：1n-9/C18：0比例降低，表明L-蘋(píng)果酸抑制了硬脂酸C18：0向油酸C18：1n-9的轉(zhuǎn)化，同時(shí)抑制了棕櫚酸C16：0向棕櫚油酸C16：1n-9的轉(zhuǎn)化，導(dǎo)致線蟲(chóng)脂肪儲(chǔ)存減少。

(1)徹底性與相當(dāng)性相結(jié)合的原則。非法集資犯罪涉案財(cái)物的處置首先應(yīng)遵循徹底性原則，使被追繳的涉案財(cái)物數(shù)量最大化。同時(shí)，應(yīng)綜合考慮涉案財(cái)物的利用方式、使用頻度、價(jià)值大小、與非法集資行為的關(guān)聯(lián)程度等因素，兼顧集資人、被集資人、利害關(guān)系人、國(guó)家等各方利益，防止涉案財(cái)產(chǎn)處置的范圍被不當(dāng)擴(kuò)大。

2.3 外源添加L-蘋(píng)果酸對(duì)線蟲(chóng)脂代謝通路基因表達(dá)的影響

1.3.8 數(shù)據(jù)處理及分析 使用GraphPad 8.4.0版本軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行作圖和統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，

檢驗(yàn)進(jìn)行兩兩比較，單因素方差分析進(jìn)行組間比較，以

<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.3.5 甘油三酯檢測(cè) 用PBS緩沖液將攜帶1～3個(gè)蟲(chóng)卵的成蟲(chóng)從生長(zhǎng)板上洗下，收集于無(wú)菌的1.5 mL EP管中，清洗至肉眼無(wú)菌。超聲細(xì)胞破碎儀對(duì)線蟲(chóng)進(jìn)行破碎勻漿處理(冰水浴、超聲功率150 W、時(shí)間3 min)，破碎勻漿后以2 000 r/min離心10 min，將上清液轉(zhuǎn)移至新的1.5 mL的EP管中待測(cè)。按照甘油三酯檢測(cè)試劑盒說(shuō)明，使用96孔板進(jìn)行檢測(cè)，在空白孔里加入10 μL蒸餾水和1 000 μL的工作液，標(biāo)準(zhǔn)孔里加入校準(zhǔn)品10 μL和1 000 μL工作液，各個(gè)樣本孔中加入樣本10 μL和1 000 μL工作液，混勻后在37 ℃避光孵育10 min，酶標(biāo)儀，波長(zhǎng)510 nm，測(cè)定各孔OD值。每個(gè)組平行測(cè)定3次，取OD值得均值計(jì)算甘油三酯的含量。同時(shí)以BCA法測(cè)定各組樣本蛋白的濃度。

1.3.4 尼羅紅(NR)染色 100 mg NR粉溶于200 mL丙酮，避光攪拌2 h，-20 ℃冰箱密封儲(chǔ)存?zhèn)溆谩Ｊ褂们埃? μL儲(chǔ)備液溶于1 mL 40%異丙醇中制備為工作液。PBST(含0.01% Triton)將攜帶1～3個(gè)蟲(chóng)卵的成蟲(chóng)輕洗于1.5 mL離心管中，反復(fù)清洗3次至肉眼澄清無(wú)菌，以560 g離心1 min去除上清液。加入100 μL 40%異丙醇，并在室溫下震蕩孵育3 min，再以560 g離心1 min，去上清。加入600 μL的尼羅紅工作液混勻，室溫下避光旋轉(zhuǎn)孵育2 h。560 g離心1 min去上清，加入600 μL PBST進(jìn)行重懸，避光旋轉(zhuǎn)孵育30 min以去除多余NR染色劑，560 g離心1 min，留50 μL上清液重懸。取15 μL線蟲(chóng)懸浮液置于載玻片上，使用FITC/GFP通道，相同曝光時(shí)間進(jìn)行成像。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，每個(gè)組拍攝不少于20條。

世界腕表不僅得到精英階層們爭(zhēng)相追捧，也深受各國(guó)政要們的喜愛(ài)。日內(nèi)瓦人民更是以世界時(shí)表作為禮物，饋贈(zèng)予那些在第二次世界大戰(zhàn)中為和平而戰(zhàn)的軍事領(lǐng)袖。這些藝術(shù)與科學(xué)融合的作品，得到了領(lǐng)導(dǎo)人們極高的贊譽(yù)。

2.4 外源添加L-蘋(píng)果酸fat-6：GFP、fat-7：GFP線蟲(chóng)熒光強(qiáng)度的影響

確定L-蘋(píng)果酸降低

-5、

-6、

-7、

-1 mRNAs后，進(jìn)一步檢測(cè)

-6：GFP、

-7：GFP線蟲(chóng)熒光強(qiáng)度變化。與對(duì)照組(0 μg/mL)相比，200、500、1 000 μg/mL L-蘋(píng)果酸喂養(yǎng)線蟲(chóng)，

-6：GFP、

-7：GFP熒光強(qiáng)度減弱(圖4A、4B)，

-6：GFP熒光強(qiáng)度分別下降為對(duì)照組的0.68、0.58和0.36倍(

<0.05)(圖4C)，

-7：GFP熒光強(qiáng)度分別下降為對(duì)照組的0.75、0.38和0.28倍(

<0.05)(圖4D)。進(jìn)一步證實(shí)L-蘋(píng)果酸抑制轉(zhuǎn)錄因子

-1表達(dá)，進(jìn)而降低fat-5、fat-6、fat-7蛋白表達(dá)，抑制硬脂酸C18：0向油酸C18：1n-9的轉(zhuǎn)化，同時(shí)抑制了棕櫚酸C16：0向棕櫚油酸C16：1n-7的轉(zhuǎn)化，導(dǎo)致線蟲(chóng)脂肪儲(chǔ)存的減少。

3 結(jié)論

線蟲(chóng)基因組共包含3個(gè)SCD基因

-5、

-6和

-7

，其中

-5主要將棕櫚酸(C16：0)轉(zhuǎn)化為棕櫚油酸(C16：1n-7)，而

-6和

-7均將硬脂酸(C18：0)轉(zhuǎn)化為油酸(C18：1n-9)

。

-1編碼了秀麗隱桿線蟲(chóng)的哺乳動(dòng)物SREBP同源基因，SREBP是脂肪酸、膽固醇和其他脂質(zhì)代謝的關(guān)鍵調(diào)控因子

。在線蟲(chóng)中，

-49與PPAR

和

-1(SREBP的同源基因)序列相似調(diào)控SCD基因

-5、

-6和

-7的表達(dá)。

-1的突變導(dǎo)致油酸(C18：1n-9)與硬脂酸(C18：0)的比例下降

。研究發(fā)現(xiàn)，L-蘋(píng)果酸降低秀麗隱桿線蟲(chóng)體內(nèi)脂肪和甘油三酯，使得脂肪酸含量發(fā)生變化，C16：1n-7/C16：0和C18：1n-9/C18：0比例降低。其機(jī)制為L(zhǎng)-蘋(píng)果酸抑制轉(zhuǎn)錄因子

-1表達(dá)，進(jìn)而降低

-5、

-6、

-7基因表達(dá)，抑制硬脂酸、棕櫚酸向油酸和棕櫚油酸的轉(zhuǎn)化，導(dǎo)致線蟲(chóng)脂肪儲(chǔ)存的減少。

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