多年生黑麥草LpPIL5基因特征分析及轉錄調控

姚佳明，何悅，郝歡歡，黃心如，張敬，徐彬

（南京農業大學草業學院，江蘇 南京 210095）

光是植物生長發育最重要的調控因子之一。植物長期處于黑暗條件下，會呈現莖細長柔弱、子葉不展開、葉片細小、葉片黃化等特征；而在正常光下，植物則呈現出莖粗壯、子葉展開和葉片發達等表型，這種受光強、光質或光周期調節的生長發育過程稱為植物的光形態建成［1-2］。光敏色素是一種可溶性色素蛋白，以吸收紅光的非活性形式（red-absorbing phytochrome，Pr）和吸收遠紅光的活性形式（far red-absorbing phytochrome，Pfr）存在，具有生理活性的Pfr能夠快速地從細胞質轉移到細胞核，通過結合光敏色素互作因子（phytochrome-interacting factors，PIFs），進而調控光響應基因的轉錄水平［3-4］。PIFs屬于bHLH（basic helix-loop-helix）轉錄因子家族的一個亞家族，是光信號通路關鍵轉錄因子［5］，通過直接調控其下游基因的轉錄來抑制種子萌發、促進幼苗光形態建成和提高植物耐蔭性等［6］。PIFs中的bHLH功能域由約15個氨基酸組成的堿性區（basic region）和約60個氨基酸組成的螺旋-環-螺旋（helix-loop-helix）區組成，其中的堿性區能夠與順式作用元件G-box（CACGTG）特異性地結合，調控靶基因表達［7-15］。

近年來，越來越多的研究證實PIF家族成員不僅是光信號調節途徑的關鍵轉錄因子，還常作為細胞信號樞紐，能夠整合多種信號，成為其他信號通路的關鍵組成部分。例如，PIF在光信號和植物激素信號傳導之間起到重要的橋梁作用［16］。PIF家族成員之間的功能也存在差異［17］，例如，擬南芥（Arabidopsis thaliana）中有8個PIFs成員［18］，包括PIF1（PIL5，At2G20180），PIF3（At1G09530），PIF4（At2G43010），PIF5（PIL6，At3G59060），PIF6（PIL2，At3G62090），PIF7（At5G61270），PIF8（At4G00050）和PIL1（At2G46970）。PIF1在黑暗條件下負調控葉綠素的合成和種子萌發，而光誘導PIF1的降解減緩了這一負調控作用，進而促進擬南芥光形態建成［12］；將擬南芥pif4缺失突變體幼苗和野生型擬南芥幼苗從22℃轉移到28℃時發現，pif4突變體幼苗明顯缺乏下胚軸和上胚軸伸長以及葉片下垂的能力。此外，這種溫度變化還會引起PIF4轉錄水平快速升高［19-20］；在光照條件下，PIF3能通過誘導光敏色素B的降解來降低植物對光的響應從而調節擬南芥下胚軸的伸長［21］。小麥（Triticum aestivum）TaPIF3突變體和過表達株系的表型分析也表明，TaPIF3在莖的伸長和穗的生長調控中都發揮了作用［22］。PIFs不僅調控植物的光形態建成，還參與植物對逆境的響應。如Yong等［23］研究結果表明過量表達ZmPIF3在不影響玉米（Zea mays）產量的同時，能夠提高玉米的耐旱性。過量表達水稻（Oryza sativa）OsPIL1基因不僅提高了轉基因植物的耐旱性，還促進了細胞伸長生長［24］。Zhang等［25］研究發現擬南芥光敏色素互作因子AtPIF5具有正調控黑暗誘導葉片衰老和葉綠素降解的功能。另外，擬南芥AtPIF5也能夠調控乙烯合成和植物激素信號傳導［26］。基于以上研究結果，光敏色素互作因子（PIFs）在植物光形態建成、耐逆調控和激素信號傳導中發揮著重要作用，因此，克隆多年生黑麥草（Lolium perenne）PIFs基因，并分析其轉錄調控模式，可為黑麥草的耐逆（耐蔭、旱和鹽等）生物技術育種提供重要的候選基因。

多年生黑麥草為禾本科早熟禾亞科黑麥草屬植物，是重要的冷季型牧草和草坪草。常作為草坪建植的先鋒草種，廣泛應用于我國的南北過渡帶及以北溫帶地區。目前，對于多年生黑麥草PIF基因家族成員的克隆、表達模式分析及功能的研究尚未見報道。本研究從多年生黑麥草中克隆得到一個光敏色素因子（PIFs）編碼基因，命名為LpPIL5，并分析了其基因組結構，啟動子順式作用元件，亞細胞定位和不同組織下的表達特性以及在不同非生物脅迫下的表達規律。研究結果可為多年生黑麥草LpPIFs轉錄因子的功能分析奠定基礎，也可為黑麥草耐逆育種提供基因資源。

1 材料與方法

試驗于2020年6月-2021年6月在南京農業大學草業學院草類生理生化與分子生物學實驗室進行。

1.1 試驗材料與主要試劑

以多年生黑麥草（品種為Buena Vista，購買于美國Syngenta公司）為試驗材料，在人工氣候室中培養，基質為蛭石、珍珠巖和泥炭土（體積比為1∶3∶9）。氣候室生長條件設定為：25/20℃（白天/晚上），光照14 h，濕度為70%，光合有效輻射為750 μmol·m-2·s-1。

RNA提取試劑盒、DNA瓊脂糖凝膠回收試劑盒及質粒提取試劑盒購于OMEGA BIO-TEK公司；反轉錄試劑盒（MonScriptTMRTⅢSuper Mix with dsDNase）及熒光定量試劑盒（MonAmpTMChemoHS qPCR Mix）購于Monad公司；DNA聚合酶（Phanta?Max Super-Fidelity DNA Polymerase）購于諾維贊生物科技股份有限公司。

1.2 LpPIL5全 長cDNA擴 增 及 測 序

以擬南芥AtPIF5基因的bHLH功能域序列為誘餌，在多年生黑麥草基因組數據庫（SRA號：PRJNA335527）進行檢索（basic local alignment search tool，BLAST），篩選出LpPIL5基因，利用BioXM預測LpPIL5基因編碼區序列，用Primer Premier 5設計基因全長引物（表1），以多年生黑麥草葉片cDNA為模板進行PCR擴增，擴增體系為30 μL，包括：2×Phanta Max buffer 15 μL，dNTP Mix（10 mmol·L-1）0.6 μL，LpPIL5-cDNAF（10 μmol·L-1）1.2 μL，LpPIL5-cDNAR（10 μmol·L-1）1.2 μL，Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase 0.6 μL，cDNA模版1 μL，ddH2O 10.4 μL。擴增程序為：95℃預變性3 min，95℃變性15 s，60℃退火15 s，72℃延伸1 min，35個循環。將PCR產物切膠純化，經BamHI和HindⅢ雙酶切后連接至入門載體pEND-Linker，轉化大腸桿菌感受態細胞，挑取陽性單克隆并測序。

表1 試驗所用引物Table 1 Primers used in the study

1.3 LpPIL5基因序列分析

從TAIR和NCBI數據庫中獲取擬南芥、水稻、玉米等物種的PIF基因及其編碼的蛋白質序列，利用MEGA 6.0軟件中的ClustalW程序對LpPIL5與擬南芥、水稻和玉米等物種的PIF同源蛋白進行比對，利用Neighborjoining程序構建系統進化樹。利用Protparam分析LpPIL5蛋白的分子式，利用NetPhos預測該蛋白可能的磷酸化位點，用SOMPA和SWISS-MODEL分別模擬LpPIL5的二維和三維結構，用Plant Care網站預測LpPIL5啟動子上游1500 bp內所包含的順式作用元件。

1.4 晝夜節律表達模式分析

晝夜節律設定為白天和黑暗各12 h，間隔4 h取樣，試驗周期為48 h（圖1）。固定時間點取樣，提取mRNA，采用1%瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計（NanoDrop 2000，Thermo，美國）檢測mRNA質量，將無明顯降解的mRNA反轉錄成cDNA。用羅氏熒光定量系統（Roche Light Cycler?480Ⅱ）并結合2-ΔΔCT［27］計算方法檢測LpPIL5基因的相對表達量，LpeLF4A［28］為內參基因（GenBank登錄號為：G0924770）。

圖1 取樣時間Fig.1 Sampling time

1.5 基因表達模式及不同組織間的表達量分析

選取長勢一致的種子苗（萌發后3周）進行水培處理，培養液為Hoagland營養液，1周后進行15%聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）6000、100 mmol·L-1NaCl、100 μmol·L-1CdCl2、50 μmol·L-1脫 落 酸（abscisic acid，ABA）、25 μmol·L-16-芐氨基嘌呤［N-（phenylmethyl）-9H-purin-6-amine，6-BA］和高溫（38℃）處理，于0、0.5、2、6、12和24 h后剪取葉片和根，-80℃條件下凍存。相同時間點剪取未進行逆境和激素處理的葉片和根，作為平行對照。另外，選取多年生黑麥草的伸展葉、成熟葉、老葉、根、莖和根冠部位，用于分析目標基因在不同組織、器官中的表達模式。

1.6 亞細胞定位表達載體構建

將LpPIL5經BamHI和HindⅢ雙酶切連接入門載體pEND-linker，然后用PvuⅠ將構建好的pEND-LpPIL5線性化，純化后將其與表達載體（p2GWF7.0）進行LR重組反應，構建p2GWF7.0-LpPIL5亞細胞定位載體。

1.7 多年生黑麥草原生質體提取

參照Yu等［29］的方法提取多年生黑麥草原生質體，其中酶解液、W5溶液和MMg溶液配方見表2。

表2 提取并轉化原生質體所用溶液Table 2 The solution used to extract and transform protoplasts

1.8 亞細胞定位分析

取原生質體溶液200 μL（約40000個原生質體），質粒p2GWF7.0-LpPIL5（1000 ng·μL-1）20 μL，PEG 4000溶液（見表2）220 μL加入2 mL無菌離心管中混勻。室溫孵育5 min，加入800 μL的W5溶液，混勻后200 r·min-1離心2 min，去除上清液并加入400 μL的W5溶液重懸原生質體。室溫下暗孵育12 h后，采用激光共聚焦顯微鏡（Zeiss LSM780 Exciter，德國）觀察目標蛋白的亞細胞定位情況。

1.9 數據處理與分析

采用SPSS 23.0對基因定量數據進行統計和差異顯著性分析（P＜0.05），數據以平均值±標準誤差的形式表示。利用SigmaPlot 12.5、MEGA 6.0和Excel 2013軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 多年生黑麥草LpPIL5全長cDNA克隆與生物信息學分析

經PCR反應，從多年生黑麥草中擴增出LpPIL5基因序列（圖2，GenBank登錄號為MZ188927），其具有5個外顯子，4個內含子，編碼區長1410 bp（圖3a）。NCBI數據庫檢索得到LpPIL5的直系同源蛋白，分別為大麥（Hordeum vulgare）HvPIL1、二穗短柄草（Brachypodium distachyon）BdPIF1、小米（Setaria italica）SiPIL1、柳枝稷（Panicum virgatum）PvPIL13、高粱（Sorghum bicolor）SbPIF1、玉米ZmPIL5和水稻OsPIL13，這些蛋白都具有保守的bHLH結構域（圖3b）。進化結果表明，LpPIL5與單子葉植物的同源蛋白聚為一類，且與大麥HvPIL1的親緣關系最近（圖4）。

圖2 部分樣品的mRNA（a）及LpPIL5基因（b）全長克隆的電泳圖Fig.2 Electrophoretogram of some samples’mRNA（a）and full length of LpPIL5 gene（b）

圖3 LpPIL5的基因結構（a）和氨基酸序列（b）分析Fig.3 Gene structure（a）and amino acid sequence（b）analysis of LpPIL5

圖4 LpPIL5及其同源蛋白的系統進化樹分析Fig.4 Phylogenetic analysis of LpPIL5 and its homologous proteins

2.2 LpPIL5具有典型的bHLH三級結構

LpPIL5編碼蛋白質的分子式為C2150H3368N652O686S28，原子總數為6884，相對分子質量為50.22 kDa，等電點為6.68；正電荷殘基（精氨酸+賴氨酸）為43個，負電荷殘基（天冬氨酸+谷氨酸）為46個；不穩定系數為61.84，屬不穩定蛋白；平均親水性系數為-0.657。且其結構中含有49個磷酸化位點（閾值＞0.5），其中28個絲氨酸、19個蘇氨酸及2個酪氨酸。

LpPIL5蛋白的二級結構如圖5a所示。其中α-螺旋由137個氨基酸殘基組成，占29.15%；延伸鏈由38個氨基酸殘基組成，占8.09%；β-轉角由14個氨基酸殘基組成，占2.98%；無規則卷曲由281個氨基酸殘基組成，占59.79%。LpPIL5蛋白的三維立體結構如圖5b所示，該蛋白具有典型的bHLH轉錄因子結構，且位于該蛋白兩端的α-螺旋可以形成拉鏈結構，嵌入到DNA雙鏈的大溝里，而在這兩個α-螺旋末端均富含堿性氨基酸，以識別DNA序列。

圖5 LpPIL5蛋白的二級結構和空間三維結構Fig.5 Secondary structure and three-dimensional structure of LpPIL5

2.3 LpPIL5定位于細胞核

將p2GW7.0-LpPIL5-GFP融合表達載體瞬時轉化多年生黑麥草原生質體，用激光共聚焦顯微鏡觀察綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP）信號的定位。結果表明GFP信號與4′，6-二脒基-2-苯基吲哚（4′，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）信號重疊（圖6），說明LpPIL5定位于細胞核。

圖6 LpPIL5蛋白在多年生黑麥草原生質體中的亞細胞定位Fig.6 The subcellular localization of LpPIL5 protein in protoplasts of perennial ryegrass

2.4 LpPIL5啟動子具有激素、逆境和光響應順式作用元件

LpPIL5啟動子區含有響應逆境、植物激素和光響應相關的順式作用元件，如與脫落酸有關的順式調控元件ABRE、干旱誘導相關的MYB結合位點MBS、啟動子和增強子區域的共同順式作用元件CAAT-box、調控啟動子轉錄的基本元件TATA-box等。另外，啟動子區域也含有如G-box、I-box、BoxⅡ、TCCC-motif等多個光響應元件（表3），說明LpPIL5可能參與植物的激素信號傳導、耐逆響應和晝夜節律調控。

表3 LpPIL5啟動子順式作用元件分析Table 3 The analysis of cis-acting regulatory elements in the LpPIL5 promoter

2.5 LpPIL5的表達具有組織特異性，且受晝夜節律調控

LpPIL5在多年生黑麥草伸展葉、成熟葉、老葉、根、莖、葉鞘和根冠中均表達（圖7a）。葉片中LpPIL5的表達量顯著高于根、莖、葉鞘和根冠，其中，在成熟葉中的表達量最高。另外，LpPIL5的表達受光周期調控，如在光下的相對表達量要明顯高于黑暗。在光照開始0～4 h，其表達量上升最為明顯，隨后會有不同程度的下降。而在黑暗條件下，該基因的表達量顯著低于光照條件，且處于較低水平（圖7b）。

圖7 LpPIL5在不同組織（a）和光照條件（b）下的相對表達量Fig.7 Relative expression of LpPIL5 gene in different tissues（a）and light or dark conditions（b）

2.6 干旱、鹽、鎘和高溫逆境調控LpPIL5的表達

PEG、NaCl、CdCl2和高溫脅迫處理條件下葉片中LpPIL5基因的相對表達量均低于對照，說明4種非生物脅迫的逆境處理均抑制了葉片中LpPIL5基因的表達（圖8）。在根中PEG、NaCl、CdCl2和高溫脅迫處理6 h內，LpPIL5基因的相對表達量也低于對照，然而在處理24 h后，LpPIL5基因在根中的表達量均高于對照。

圖8 4種非生物脅迫處理下多年生黑麥草葉片和根中LpPIL5的相對表達量Fig.8 The relative expression of LpPIL5 in leaves and roots in response to four different abiotic stresses

2.7 細胞分裂素和脫落酸調控LpPIL5的表達

兩種激素處理條件下，LpPIL5在根和葉片中的表達模式也具有差異（圖9）。LpPIL5在葉片中的表達均受ABA和6-BA的抑制，但抑制程度不同。如：6-BA處理0.5～2 h時，LpPIL5表達量呈上升的趨勢，但ABA處理0.5～2 h，LpPIL5表達量呈下降的趨勢。在根中，LpPIL5在6-BA和ABA處理下的表達模式是相似的，均表現為前12 h內，該基因的表達受到抑制，但在24 h時，該基因的相對表達量高于對照。

圖9 ABA和6-BA處理下多年生黑麥草葉片和根中LpPIL5的相對表達量Fig.9 The relative expression of LpPIL5 in leaves and roots in response to ABA and 6-BA

3 討論

光在植物生長發育中起著至關重要的作用，不僅參與植物的光合作用，還作為信號調節多種生理反應，如光形態建成等。光敏色素主要在細胞質中合成，在紅光照射下會快速移動到細胞核中，然后與PIFs蛋白發生相互作用，促進它們的快速降解來調節植物的生長發育過程［30］。光敏色素互作因子作為bHLH轉錄因子的亞家族，是參與光信號通路的關鍵調控因子，在植物生長發育中發揮著重要作用［6］。隨著生物技術的不斷發展，目前，越來越多的PIF轉錄因子家族在植物中被發現并研究。如PIF轉錄因子已經在水稻［31］、番茄（Solanum lycopersicum）［32］、擬南芥［18，33］、小立碗蘚（Physcomitrella patens）［34］和玉米［35-36］等多種植物中被發現并分離。但是，多年生黑麥草的PIF轉錄因子家族成員尚未被克隆。

本研究從多年生黑麥草中克隆得到一個PIF基因LpPIL5，其編碼蛋白具有堿性螺旋-環-螺旋（basic helix-loop-helix）蛋白保守的bHLH結構域和APB功能域。前人研究結果表明，光敏色素A和B可以與PIFs的APA和APB功能域互作，促進PIF降解進而發揮生物學功能［37-38］。然而，本研究發現LpPIL5不含有APA功能域，說明其可能不與光敏色素A直接互作。對LpPIL5蛋白進行空間三維立體結構模擬，發現其具有典型的bHLH結構域特征，位于該蛋白兩端的α-螺旋形成拉鏈結構，能夠嵌入DNA雙鏈結構的大溝，而在這兩個α-螺旋末端均富含堿性氨基酸，以識別DNA序列。前人研究發現，PIFs可以通過其bHLH結構域的基本區域與下游基因的順式作用元件結合［39］。基于以上結果，并結合LpPIL5定位于細胞核，推測LpPIL5是一個轉錄激活子，通過bHLH功能域與其下游基因啟動子結合并促進下游基因的表達，進而發揮生物學功能。

分析LpPIL5基因的表達模式有助于揭示其調控多年生黑麥草耐逆反應、激素響應和光形態建成的機制。Wang等［40］的研究表明兩對AhPIF3基因（AhPIF3A1/B1，AhPIF3A4/B4）在黑暗下的轉錄水平要高于在光下的轉錄水平。與上述結果相似的是葡萄（Vitis vinifera）VvPIFs在光下的轉錄水平也會被抑制，并且暗處理可誘導其表達［41］。除此之外，AtPIF3在黑暗條件下的擬南芥幼苗中表達量高，但在紅光和遠紅光條件下都會被降解［42］。本研究結果表明LpPIL5的表達受光調控，表現為白天的表達量顯著高于夜晚，并且在其啟動子區發現了許多與光響應相關的順式作用元件，如G-box、I-box、BoxⅡ、TCCC-motif等。因此，推測LpPIL5基因功能發揮與光信號密切相關，是植物光信號通路的核心調控因子，且LpPIL5啟動子為光誘導型啟動子，光照能夠驅動或誘導LpPIL5基因的表達，進一步調節植物的光形態建成［43］。因此，LpPIL5是調控多年生黑麥草光形態建成及耐蔭響應的重要候選基因。前人研究顯示，AdPIF3A4/AiPIF3B4基因在雌蕊發育早期的表達量高于其他組織［44］，本研究發現LpPIL5基因在植物葉片中的表達量顯著高于其他部分，并且在葉片不同時期內的表達量也有所不同，其中在成熟葉片中表達量最高，說明該基因在多年生黑麥草發育過程中可能具有不同的生物學功能。

不同非生物脅迫和兩種外源激素處理的定量數據結果表明，LpPIL5基因在葉片中受NaCl、CdCl2、高溫、干旱、ABA和6-BA處理后均表現為先上升后下降的表達趨勢。而在聚乙二醇（PEG）處理后的0.5 h內其基因表達量出現了先下降，隨后上升再下降的趨勢。但與對照組相比，不管在哪種非生物脅迫處理下，其葉片中該基因的相對表達量都下降，但下降的程度不相同，表明該基因在多年生黑麥草葉片中對逆境脅迫的響應具有重要作用，且不同逆境下其響應程度不同。在根中，不同處理下也出現了相似的表達模式，但與葉片中不同的是，在處理24 h后，該基因的相對表達量均超過了對照組。尤其是在NaCl處理下，該基因在6 h后表達量快速上升，說明LpPIL5在根部受NaCl的影響要高于其他處理組。根和葉的相對表達量數據分析也表明，LpPIL5基因在根和葉中均有不同的表達模式。LpPIL5基因表達對上述逆境及植物激素處理的響應可能與其啟動子中含有的ABRE，MBS，CGTCA-motif和TGACG-motif等順式作用元件相關，但與其啟動子互作的逆境和激素響應轉錄因子仍需進一步挖掘。綜上所述，LpPIL5不僅具有參與光信號轉導的能力，而且在響應鹽、鎘、高溫、干旱等非生物脅迫方面也發揮著重要作用。

4 結論

本研究克隆了多年生黑麥草LpPIL5基因，發現LpPIL5與大麥HvPIL1遺傳距離較近，且具有bHLH蛋白保守的結構域和APB功能域；LpPIL5定位于細胞核；與其他組織相比，LpPIL5在多年生黑麥草葉片中表達量較高；并且其在葉片和根中表達量均受NaCl、CdCl2、PEG、高溫、ABA和6-BA等調控。另外，LpPIL5基因的表達受晝夜節律調控，如LpPIL5在白天的表達量顯著高于夜晚。本研究初步明確了LpPIL5不僅在光信號通路中起著至關重要的作用，而且還參與多年生黑麥草耐逆調控，研究結果為后續揭示LpPIL5基因調控多年生黑麥草光形態建成和耐逆（如耐蔭）機制提供了理論基礎。