陰道微生態失衡與HR-HPV感染及宮頸病變的關系

智艷芳，劉 慧，張 婷，班振英，張 威，曾憲旭

(鄭州大學第三附屬醫院，河南 鄭州 450052)

子宮頸癌是女性癌癥死亡的第四大原因，全球每年約有50萬宮頸癌新發病例和30萬死亡病例[1]。目前，消除宮頸癌已成為國際社會共同關注的熱點。在我國，宮頸癌的發病不容忽視，2018年中國宮頸癌新發病例近11萬，死亡病例近5萬[2]。盡管高危型人乳頭瘤病毒(high-risk human papilloma virus，HR-HPV)持續感染是宮頸癌發生的重要危險因素[3-4]，但截止目前，宮頸癌的發病機制仍不十分明確。近年來研究顯示，陰道微生態失衡很可能參與了宮頸病變的發生及發展[5-6]。

陰道微生態是由陰道解剖結構、周期性的內分泌變化、陰道局部免疫系統和陰道內微生物菌群組成，陰道正常微生物菌群是陰道微生態的核心內容[7]。研究表明，微生物群在許多器官中具有促癌作用，如幽門螺桿菌感染可能導致胃炎、胃潰瘍、胃黏膜萎縮及最終胃癌的發生[8]；結腸內菌群與宿主的相互作用可能導致結、直腸癌的發生[9-10]。目前，女性生殖道內大量的細菌微生物群落是否具有類似的促癌作用尚不明確。因此，本研究比較并分析了經宮頸薄層液基細胞學檢查(thinprep cytologic test，TCT)異常與正常者的陰道微生態變化及HR-HPV感染情況，旨在探討陰道微生態與HR-HPV感染及宮頸病變發生的關系，以期為宮頸癌的預防及治療提供有效的參考依據。

1 研究對象與方法

1.1 研究對象

選取2018年7月到2021年3月就診于鄭州大學第三附屬醫院婦科門診行TCT、HR-HPV及陰道微生態檢測的患者1 200例，年齡為20～55歲，平均年齡(35.28±8.34)歲。患者中TCT結果陽性600例為陽性組，其中未明確意義的非典型鱗狀上皮細胞(atypical squamous cells of undetermined significance，ASCUS)組300例、低度鱗狀上皮內病變(low grade squamous intraepithelial lesion，LSIL)組150例、高度鱗狀上皮內病變(high grade squamous intraepithelial lesion，HSIL)組100例、宮頸鱗癌(squamous cell carcinoma，SCC)組50例。TCT結果陰性600例為陰性組。

1.2 納入和排除標準

納入標準：①年齡在20～55歲，有性生活史；②月經規律，檢查時未絕經；③檢查前3天未進行陰道沖洗、用藥及性行為；④檢查前2周無抗生素和激素用藥史；⑤自愿接受宮頸HPV、TCT篩查和陰道微生態檢測。

排除標準：①妊娠期或哺乳期婦女；②有宮頸錐切或全子宮切除史；③有其他生殖器官感染性疾病；④合并嚴重的心、肝、腎、造血系統等疾病及精神病；⑤使用免疫抑制劑，患有各種免疫性疾病或惡性腫瘤等免疫功能低下者。

該研究經鄭州大學第三附屬醫院倫理委員會批準(2017醫倫審第88號)。

1.3 標本的采集

陰道分泌物的采集：窺陰器暴露宮頸，將無菌棉棒置于陰道上1/3側壁輕輕刮取3～5次，所采樣本置入塑料軟管中盡快檢測。

宮頸脫落細胞的采集：窺陰器暴露宮頸，用TCT專用刷取材，將刷頭中間部分深入宮頸內口，兩側抵住宮頸外口，順時針旋轉3～5圈，將刷頭放入裝有細胞保存液的樣品管中充分涮洗，擰緊瓶蓋，貼好標簽送檢TCT及HR-HPV。

1.4 臨床實驗室的檢測

1.4.1 TCT的檢查

由鄭州大學第三附屬醫院病理科3名經驗豐富的細胞病理學醫生根據宮頸細胞學The Bethesda System 2014版報告系統進行診斷。細胞學結果具體分類為：ASCUS、LSIL、HSIL和SCC。

1.4.2 HR-HPV的檢測

嚴格按HR-HPV E6/E7(16、18/45)mRNA試劑盒使用說明書進行操作，檢測HPV16、HPV18/45型，通過信號擴增法進行定量檢測。結果判讀標準：根據信號-截點(S/CO)比值進行結果判讀，S/CO值>0.5判讀為陽性；反之則判讀為陰性。

1.4.3 宮頸陰道分泌物的檢測

將分泌物濕片鏡檢，并用陰道炎聯合檢測試劑盒檢測分泌物中的過氧化氫、白細胞酯酶、唾液酸苷酶、脯氨酸氨基肽酶、乙酰氨基葡萄糖苷酶及pH值，嚴格按照說明書操作。過氧化氫<2μmol/L為陽性，唾液酸苷酶≥7IU/L為陽性，脯氨酸氨基肽酶≥1.1IU/L為陽性，白細胞酯酶≥9IU/L為陽性，乙酰氨基葡萄糖苷酶≥0.1IU/mL為陽性，pH值檢測正常范圍為3.8～4.5，乳酸桿菌高倍鏡下≥100個為陽性。

細菌性陰道炎(bacterial vaginosis，BV)判斷標準采用Amsel法：①患者陰道分泌物質稀薄；②陰道分泌物pH值>4.5；③陰道分泌物中存在線索細胞，將l滴生理鹽水加入到陰道分泌物中，使用高倍鏡觀察，視野中線索細胞超過20%；④將1滴10%的氫氧化鉀加入分泌物中，出現腥臭味。以上4項中出現任意3項即診斷為BV。

結果判讀：清潔度Ⅰ、Ⅱ度為正常，Ⅲ、Ⅳ度為異常；乳酸桿菌、過氧化氫陽性為正常，陰性為異常；加德納菌、真菌、BV、滴蟲陰性為正常，陽性為異常；雜菌、白細胞酯酶+及以內為正常，2+及以上為異常；陰道pH值3.8～4.5為正常，pH>4.5或<3.8為異常；唾液酸苷酶、脯氨酸氨基肽酶、乙酰氨基葡萄糖苷酶陰性為正常，陽性為異常。

1.5 統計學方法

應用SPSS 25.0統計學軟件分析數據，計數資料采用例數(百分率)[n(%)]表示，用R×C卡方(χ2)檢驗，用Logistic回歸模型統計微生態指標與宮頸病變的比值比(OR)及95%可信區間(CI)，并評估陰道微生態指標及HR-HPV感染在宮頸病變發生中的交互作用，檢驗水準α=0.05，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 陽性組與陰性組陰道微生態各項指標與宮頸病變的關系

與陰性組相比，陽性組乳酸桿菌、過氧化氫、白細胞酯酶的異常率及HR-HPV感染率均顯著增高，經卡方檢驗差異均有統計學意義(P<0.05)；以因變量為TCT，自變量為陰道微生態各指標及HR-HPV，通過Logistic回歸分析得出：乳酸桿菌異常時宮頸病變發生的風險是其正常時的2.319倍、過氧化氫異常時宮頸病變發生的風險是其正常時的2.201倍、白細胞酯酶異常時宮頸病變發生的風險是其正常時的3.376倍、HR-HPV感染時宮頸病變發生的風險是其非感染時的7.114倍，見表1。

表1 陽性組與陰性組陰道微生態各項指標異常率及HR-HPV感染率的比較[n(%)]Table 1 Comparison of abnormal rates of various vaginal microecological indicators and infection rate of HR-HPV between the positive group and the negative group[n(%)]

因素組別例數(n)異常例數χ2POR(95%CI)白細胞酯酶陽性組600319(53.1)98.7140.0003.376(2.644～4.310)陰性組600151(25.2)唾液酸苷酶陽性組600157(26.2)0.1090.7411.045(0.806～1.353)陰性組600152(25.3)脯氨酸氨基肽酶陽性組600154(25.6)0.3610.5481.084(0.834～1.408)陰性組600145(24.2)乙酰氨基葡萄糖苷酶陽性組600152(25.3)0.4510.5021.094(0.841～1.424)陰性組600142(23.7)HR-HPV陽性組600403(67.2)243.8920.0007.114(5.503～9.197)陰性組600134(22.3)

2.2 不同級別宮頸病變陰道微生態指標異常率及HR-HPV感染率的比較

將陽性組600例宮頸病變患者分為ASCUS組、LSIL組、HSIL組和SCC組；其乳酸桿菌、過氧化氫、白細胞酯酶的異常率及HR-HPV感染率隨宮頸病變級別的加重而明顯增高，經趨勢χ2檢驗差異均有統計學意義(P<0.05)，見表2。

再將陽性組600例宮頸病變患者進一步分為HSIL+組(包括SCC和HSIL)和LSIL-組(包括LSIL和ASCUS)，HSIL+組的乳酸桿菌、過氧化氫、白細胞酯酶的異常率及HR-HPV感染率均顯著高于LSIL-組，經比較差異均有統計學意義(P<0.05)，見表3。

表2 不同級別宮頸病變中乳酸桿菌、過氧化氫、白細胞酯酶的異常率及HR-HPV感染率的比較[n(%)]Table 2 Comparison of abnormal rates of Lactobacillus,hydrogen peroxide,leukocyte esterase and infection rate of HR-HPV in different grades of cervical lesions[n(%)]

表3 HSIL+組與LSIL-組的乳酸桿菌、過氧化氫、白細胞酯酶的異常率及HR-HPV感染率的比較[n(%)]Table 3 Comparison of abnormal rates of Lactobacillus,hydrogen peroxide,leukocyte esterase and infection rate of HR-HPV in the HSIL+ group and the LSIL- group[n(%)]

2.3 HR-HPV感染與陰道微生態指標在宮頸病變發生中的交互作用

以乳酸桿菌、過氧化氫、白細胞酯酶正常，且HR-HPV陰性者為對照，用Logistic回歸模型分析結果顯示：HR-HPV感染與乳酸桿菌、過氧化氫、白細胞酯酶的異常均存在交互作用，HR-HPV感染與乳酸桿菌異常同時存在的宮頸病變發生風險大于HR-HPV感染或乳酸桿菌異常單獨存在時，HR-HPV感染與過氧化氫異常同時存在的宮頸病變發生風險大于HR-HPV感染或過氧化氫異常單獨存在時，HR-HPV感染與白細胞酯酶異常同時存在的宮頸病變發生風險大于HR-HPV感染或白細胞酯酶異常單獨存在時，見表4。

表4 乳酸桿菌、過氧化氫、白細胞酯酶的異常與HR-HPV感染在宮頸病變發生中的交互作用Table 4 Interaction of abnormalities of Lactobacillus,hydrogen peroxide and leukocyte esterase with HR-HPV infection in the occurrence of cervical lesions

3 討論

目前認為在宮頸病變的發生發展過程中還有其他重要因素參與其中，且很有可能在HPV感染中也發揮重要作用，而陰道微生態失衡成為近年來研究的熱點之一。相關研究表明，陰道微生態與HPV感染甚至于宮頸病變的演變之間存在著密切的關系[11]。

3.1 乳酸桿菌和過氧化氫與宮頸病變的關系

正常的陰道微生態系統在預防女性生殖道感染中起著重要作用。目前對于陰道微生態系統的評價包括陰道病原微生物形態學檢測和微生物代謝產物及酶等功能學檢測[12-13]。盡管女性生殖道內微生物種類繁多，但主要以乳酸桿菌為優勢菌群。乳酸桿菌可以產生乳酸，使陰道pH值保持在3.8～4.5。此外，陰道乳酸桿菌還可以產生過氧化氫、細菌素、類細菌素等物質，可殺滅及抑制其他病原菌的生長，保持其在陰道菌群中的優勢地位，借此維持陰道微生態的平衡。陰道內一旦乳酸桿菌減少，其所產生的抗菌物質也會減少，而加德納菌及雜菌數量就會隨之增加，最終導致陰道微生態失衡；而陰道微生態一旦失衡，外來微生物便可輕易入侵并導致生殖道內的炎癥。本研究顯示：在宮頸病變患者中，陰道分泌物中乳酸桿菌、過氧化氫的異常率明顯高于正常者，且隨宮頸病變的加重，二者的異常率呈上升趨勢，與宮頸病變發生風險顯著關聯。Korshunov等[14]研究發現，宮頸上皮內瘤變患者陰道內乳酸桿菌的比例減少，各種炎癥致病菌的比例增加。逯彩虹等[15]研究結果表明，宮頸癌發生與陰道黏膜乳酸桿菌減少、陰道菌群失調相關。上述報道與本研究結果一致。可見乳酸桿菌具有很好的抗感染和預防宮頸病變的作用；而乳酸桿菌的減少、微生態的失衡，勢必會增加HPV感染的機會及宮頸病變發生的幾率。此外，有研究表明，陰道微生態內過氧化氫濃度降低與宮頸上皮內瘤變相關[16]。這與本研究結果一致。由此可見，通過測定陰道微生態中乳酸桿菌的數量、過氧化氫的濃度評估陰道微生態的平衡狀態，對HPV感染及宮頸病變的發生具有一定的預測作用；而對陰道微生態失衡進行積極的干預，則可以預防HPV感染及宮頸病變的發生。盡管有研究表明，BV與宮頸上皮內瘤變相關[17]；但本研究結果卻顯示，BV與宮頸病變的發生無明顯關聯(P=0.274)。

3.2 白細胞酯酶與宮頸病變的關系

白細胞酯酶是人體白細胞產生的一種特異性酶類，白細胞酯酶增多是白細胞增多且結構遭到破壞的直接證據，反映局部上皮黏膜組織浸潤受損與強烈炎癥反應。白細胞酯酶只存在于中性粒細胞內，因此白細胞酯酶可以反映白細胞的存在，但白細胞并不能反映白細胞酯酶的存在。陰道微生態檢測包括白細胞的測定和白細胞酯酶的測定。本研究顯示，白細胞酯酶異常率在宮頸病變患者中顯著升高，且隨宮頸病變的加重，其異常率呈明顯上升趨勢，與宮頸病變發生風險有關。這表明白細胞酯酶的異常很可能參與了HPV感染及宮頸病變的發生發展。與此同時，本研究并未發現白細胞陽性率在細胞學陰性組與陽性組間具有顯著性差異。有研究表明白細胞酯酶與宮頸癌間質浸潤相關[18]；但目前鮮見有關白細胞酯酶與宮頸病變關系的研究，其在宮頸病變發生中的相關作用尚待進一步探討。

本研究顯示，陽性組的HR-HPV感染率顯著高于陰性組，且隨宮頸病變的加重，感染率顯著上升，HR-HPV感染時宮頸病變發生的風險是其非感染時的7.114倍(95%CI：5.503～9.197)。可見，HR-HPV感染是宮頸病變發生中最重要的原因。有研究提示，陰道微生態某些指標的失衡可以促進HR-HPV感染的發生[19]，進而導致宮頸癌的發生。李俐等[20]研究發現，HPV16感染及過氧化氫、唾液酸苷酶陽性對宮頸病變的發生具有交互作用。然而，過氧化氫、唾液酸苷酶陽性與HR-HPV感染對宮頸病變發生發展產生怎樣的影響尚未明確。本研究通過Logistic回歸模型分析發現，HR-HPV感染與乳酸桿菌、過氧化氫及白細胞酯酶的異常在宮頸病變的發生中均存在顯著的交互作用，提示在考慮多種因素的基礎上，如果HR-HPV感染與乳酸桿菌、過氧化氫、白細胞酯酶的異常同時存在，則會增加宮頸病變的發生風險。因此，保持陰道微生態平衡不僅可以預防或者減少HR-HPV感染的發生，還可能會加速HPV病毒的清除，阻止宮頸病變的進展，甚至是促進宮頸病變回退正常。可見，在HR-HPV感染與宮頸病變患者的治療中，積極糾正陰道微生態紊亂顯得尤為重要。

總之，陰道微生態中乳酸桿菌、過氧化氫、白細胞酯酶的異常與HR-HPV感染存在交互作用，與宮頸病變發生密切相關。積極糾正陰道微生態失衡可能為HR-HPV感染及宮頸病變的防治提供新的診療思路。但本研究的樣本量有限，且病例具有一定的地域局限性。后期將進一步擴大樣本量，篩選與HR-HPV持續感染及病變進展過程關系密切的因子進行信號通路的研究，為指導HR-HPV持續感染后的處理及預防宮頸鱗狀上皮內病變的進展提供更多依據。