FOXO3和IL-2在干眼患者結膜上皮細胞及淚液中表達及意義

徐 艷， 唐曉蕾， 韓雙羽， 劉雪蓮

作者單位：(621000)中國四川省綿陽市，四川中醫藥高等專科學校1眼耳鼻咽喉科教研室；3內科學教研室；2(621000)中國四川省綿陽市中心醫院眼科

0引言

干眼(dry eye，DE)是眼科常見的一種疾病，主要是由于淚液質量下降和動力學異常變化而導致的眼表損傷，該疾病與患者的性別和年齡有密切的關聯，多發于女性和中老年人[1]。據統計，我國DE的發病率高達21%～30%，且有逐年增長的趨勢，嚴重影響患者的生活質量[2]。近年來，DE的發病機制逐漸引起眼科醫師的重視，但目前缺乏有效的診治標志物，因此，尋找與DE發生發展有密切關系的生物指標是十分有意義的。

叉頭框蛋白O3(forkhead box class O3，FOXO3)是FOXO家族中4大亞家族成員之一，其位于細胞質中，在多種器官中都有分布，包括眼、心、胃等，參與調控氧化應激、細胞增殖、分化、凋亡等重要生理過程[3]。白細胞介素-2(interleukin-2，IL-2)是一種多向性的炎性因子，參與機體的多種生理反應，過表達的IL-2可促進炎癥發展[4]。IL-2在多種炎癥疾病中發揮重要作用，例如糖尿病[5]、結腸炎[6]等，另有研究發現，白內障患者眼內液中IL-2水平顯著升高[7]。有研究表明，機體的氧化應激能夠激發炎癥反應的進程，二者在炎性疾病中具有協同作用[8]。因此，本研究通過探究FOXO3、IL-2在DE患者結膜上皮細胞及淚液中的表達及意義，旨在為明確DE的發病機制提供參考依據。

1對象和方法

1.1對象前瞻性研究。選取2019-03/2021-03我院收治的DE患者106例。納入標準：(1)DE患者符合干眼的診斷標準[9]；(2)患者均自愿簽署知情同意書；(3)未合并眼部其他疾病。排除標準：(1)合并其他代謝疾病；(2)眼部接受過手術；(3)患有精神疾病，不能積極配合治療者。另選同期85位健康體檢者為對照組。納入標準：(1)無眼部疾病；(2)既往無眼部手術史或激光治療史；(3)自愿加入研究。排除標準：(1)近1mo內有眼局部用藥史；(2)合并其它器官疾病者；(3)精神異常者。本研究均經受試者及家屬簽署知情同意書，且經本院倫理委員會批準。

1.2方法

1.2.1樣本采集在DE患者治療前后分別采集樣本，在對照組首次檢查時采集樣本。細胞采集：使用結膜印記細胞法，首先在受檢者雙眼結膜囊內滴入0.4%的鹽酸奧布卡因滴眼液局部麻醉，然后在結膜染色15min后收集結膜上皮細胞，將結膜聚醚礬濾膜分為2份置于球結膜上，濾膜保存于RPMI1640細胞培養液中，從濾膜中獲得細胞后放于冷凍管中，并保存于-20℃備用。淚液采集：使用毛細管采淚法，首先于受檢者雙眼內眥滴入2滴0.9%的生理鹽水，數次瞬目使淚液與生理鹽水充分混合，然后用毛細塑料管(內徑0.3～0.5mm)收集受檢者下瞼穹窿或外眥處的淚液100μL，于-20℃保存備測。

1.2.2試劑與儀器Trizol試劑(南京森貝伽生物科技有限公司)，RNA逆轉錄試劑盒(上海羽哚生物科技有限公司)，2×SYBR Green PCR Master Mix試劑盒[易默(北京)生物技術有限公司]，引物(上海韻泰信息科技有限公司)，PCR擴增儀(BIO-RAD)。

1.2.3FOXO3水平檢測DE患者樣本中均加入Trizol試劑，進行總RNA的提取；根據RNA逆轉錄試劑盒將RNA反轉錄為cDNA，按照2×SYBR Green PCR Master Mix試劑盒操作說明進行實時熒光定量PCR(real-time fluorescent quantitative PCR，qRT-PCR)試驗，qRT-PCR條件：95℃初始變性30s，95℃ 30s、60℃ 30s和72℃ 30s，進行40個循環。以GAPDH為內參，引物序列見表1。相對表達量按照2-ΔΔCT法進行計算。

1.2.4IL-2水平檢測IL-2水平檢測采用酶聯免疫吸附(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)法，嚴格按照人IL-2 ELISA試劑盒操作說明進行，試劑盒購自上海廣銳生物科技有限公司。

1.2.5臨床指標檢測淚膜破裂時間(break-up time，BUT)：將熒光素鈉溶液均勻涂抹于患者下瞼結膜囊中，用藍鉆光照射并認真觀察暴露的角膜，記錄瞬目后淚膜上第一次出現破裂點的時間，小于10s即為陽性，取3次結果的平均值；淚液分泌試驗(Schirmer Ⅰ test，SⅠt)：輕撥患者的下瞼，于下瞼結膜囊中外1/3處放入濾紙，閉眼5min后記錄濾紙濕潤的長度，小于10mm/5min為陽性。角膜熒光素染色(cornea fluorescein staining，CFS)：0級即未染色；1級即呈散狀點狀染色；2級即呈密集狀點狀染色；3級即片狀染色，陽性為2～3級。

表1 qRT-PCR引物序列

1.2.6治療方法所有DE患者均行左氧氟沙星滴眼液和聚乙烯醇滴眼液治療，均為1滴/次，每天5次，共2wk。

2結果

2.1兩組受試者一般資料比較所有患者均完成隨訪，無失訪病例。DE組106例中男36例，女70例，年齡40～61(平均52.36±4.84)歲。對照組85例中男31例，女54例，年齡40～60(平均51.61±4.79)歲，兩組受試者性別比例、年齡比較差異均無統計學意義(P>0.05)，具有可比性。

2.2兩組受試者結膜上皮細胞及淚液中FOXO3和IL-2水平比較與對照組相比，DE組患者結膜上皮細胞及淚液中FOXO3水平均明顯降低，IL-2水平均明顯升高，差異均有統計學意義(P<0.05)，見表2。

表2 兩組受試者結膜上皮細胞及淚液中FOXO3和IL-2水平比較

2.3DE患者治療前后結膜上皮細胞及淚液中FOXO3和IL-2水平比較與治療前相比，DE患者治療后結膜上皮細胞及淚液中FOXO3水平明顯上調，IL-2水平明顯下調，差異均有統計學意義(P<0.01)，見表3。

表3 DE患者治療前后結膜上皮細胞及淚液中FOXO3和IL-2水平比較

2.4結膜上皮細胞和淚液中FOXO3和IL-2水平的相關性Pearson相關性分析結果顯示，結膜上皮細胞、淚液中FOXO3和IL-2水平均呈顯著負相關(r=-0.531，P<0.01；r=-0.469，P<0.01)，圖1、2。

圖1 結膜上皮細胞中FOXO3和IL-2水平的相關性。

圖2 淚液中FOXO3和IL-2水平的相關性。

2.5DE患者治療前后臨床指標變化DE患者治療后BUT、SⅠt指標較治療前上升，CFS指標下降，差異均有統計學意義(P<0.01)，見表4。

表4 DE患者治療前后臨床指標變化

2.6DE患者結膜上皮細胞FOXO3和IL-2水平與臨床指標的關系DE患者結膜上皮細胞FOXO3與BUT、SⅠt呈正相關，與CFS呈負相關，IL-2與BUT、SⅠt呈負相關，與CFS呈正相關(均P<0.01)，見表5。

表5 DE患者結膜上皮細胞FOXO3和IL-2水平與臨床指標的關系

2.7DE患者淚液FOXO3和IL-2水平與臨床指標的關系DE患者淚液FOXO3與BUT、SⅠt呈正相關，與CFS呈負相關，IL-2與BUT、SⅠt呈負相關，與CFS呈正相關(均P<0.01)，見表6。

表6 DE患者淚液FOXO3和IL-2水平與臨床指標的關系

3討論

隨著人們生活環境、生活方式的改變及電子設備的使用率提高，DE的發生率也在不斷上升，其具有女性比男性多，老年人高于青年人的發病特點。DE患者常常感覺眼睛干澀、有異物感、畏光、腫痛等，嚴重者甚至會引發結膜病變，造成視力低下，給人們的生活帶來了許多的不便[10]。研究表明，DE的發生機制是由多種因素共同造成的，包括氧化應激、炎癥、神經功能障礙、細胞凋亡等，其中氧化應激和炎癥為DE發病的主要原因[11-12]。

FOXO3是FOXO家族中的一員，可在細胞核中與DNA結合，人們認為FOXO3是一種長壽基因，存在于機體的多種器官中[13]。FOXO3從細胞質到細胞核，通過調控相關基因表達而發揮抗氧化應激、調節細胞代謝等重要作用[14-15]。Chen等[16]研究表明，視網膜靜脈阻塞患者血清中的FOXO3水平較對照組顯著降低，且該疾病會促使患者發生全身氧化應激。Li等[17]研究表明，與年齡相關性白內障患者相比，糖尿病性白內障患者前囊細胞中AMPK依賴性轉錄因子FOXO3水平受到抑制，同時細胞的自噬活性隨之下調，這可能是糖尿病白內障的潛在機制。有研究表明氧化應激與DE的發生密切相關。Liu等[18]研究發現，糖尿病DE小鼠角膜氧化應激明顯增強，且角膜FOXO3水平較對照組顯著降低。本研究結果發現，DE組患者結膜上皮細胞及淚液中FOXO3水平較對照組呈低表達，考慮可能與DE發病后氧化應激的增強有關；經過治療，DE患者FOXO3水平明顯上調，且BUT、SⅠt指標較治療前明顯上升，CFS指標明顯下降，與Chen等[16]、Liu等[18]研究相似，提示FOXO3參與了DE的發生，經治療后患者的眼表功能得到了一定的恢復。DE患者結膜上皮細胞、淚液FOXO3水平與BUT、SⅠt均呈顯著正相關，與CFS呈顯著負相關，提示FOXO3可反映DE患者病情的嚴重程度，可能是DE臨床檢測的生物標志物。

IL-2是由113個氨基酸殘基組成的糖蛋白，為趨化因子家族中的一員，主要由T細胞和樹突狀細胞產生，參與多種生理和病理過程[19-20]。Pinto-Fraga等[21]研究發現，DE患者在接受治療第22d后IL-2濃度顯著下降，并表明IL-22可能是治療DE的潛在生物標志物。Chen等[22]通過研究DE模型小鼠表明，在DE急性期IL-2的水平有所增加，而在炎癥緩解后，IL-2水平下降到基線水平。Kwon等[23]研究發現糖尿病性黃斑水腫患者房水中IL-2水平較白內障患者顯著升高。本研究中，DE組患者結膜上皮細胞及淚液中IL-2水平表達增加，DE患者治療后結膜上皮細胞及淚液中IL-2水平較治療前明顯下調，與Pinto-Fraga等[21]、Kwon等[23]研究類似，提示IL-2參與DE發病，且其水平降低可能與患者病情得到緩解有關。DE患者結膜上皮細胞、淚液IL-2與BUT、SⅠt均呈顯著負相關，與CFS呈顯著正相關，提示IL-2在DE的發生過程中發揮促進作用，有望成為DE臨床監測及療效評估的有效參考指標。Pearson相關性分析結果顯示，結膜上皮細胞、淚液中FOXO3和IL-2水平均呈顯著負相關，提示其機制可能為患者機體FOXO3水平下降，抗氧化應激作用失效，氧化損傷發生，從而誘發炎癥因子的釋放，IL-2水平上升，進而導致DE的發生發展。

綜上所述，DE患者結膜上皮細胞及淚液中FOXO3水平降低，IL-2水平升高，二者與患者眼表指標存在密切的聯系，可判斷DE病情的發展狀況，有望成為DE臨床監測及療效評估的實驗室輔助指標。DE的發病機制復雜，FOXO3、IL-2在DE發病過程中的具體機制尚需在今后的研究中進一步探索，從而為DE的防治提供可靠的參考依據。

2陳旭, 申穎. SCD-1、LYSC在干眼癥患者結膜上皮細胞及淚液中表達及意義. 內蒙古醫科大學學報 2020;42(4):444-448