基于加權基因共表達網絡分析非動脈炎性前部缺血性視神經病變的關鍵基因

尚孟秋，廖 良

作者單位：1(100020)中國北京市，北京中醫藥大學；2(100078)中國北京市，北京中醫藥大學東方醫院眼科

0引言

非動脈炎性前部缺血性視神經病變(nonarteritic anterior ischemic optic neuropathy, NAION)的發病率約為2.3/100000～10.2/100000[1]，臨床上常以急性視力下降和視野缺損為主要癥狀。NAION可導致嚴重視功能損害，但目前臨床上尚無特效治療方法[2]，主要通過改善視網膜血液循環以提高患者視功能；且NAION發病機制尚未明確，其分子機制仍待進一步研究。生物信息學通過聯系計算機與自然科學，能夠解釋復雜的生物機體，為研究疾病的生物學過程及分子機制提供新思路。加權基因共表達網絡分析(weighted gene coexpression network analysis, WGCNA)是依據基因與基因間的互作關系構建的加權網絡[3]，在處理大量樣本的復雜數據時存在優勢，現已應用于癌癥、心衰等多種疾病[4]。本研究中使用WGCNA方法篩選出與NAION臨床特征高度相關的模塊，并對模塊內進行通路富集分析與關鍵基因篩選，并通過關鍵基因預測相關微小RNA(micro ribonucleic acid，miRNA),從而為闡明NAION的發病機制提供有力支持。

1材料和方法

1.1數據預處理與加權基因共表達網絡構建從基因表達數據庫GEO(https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)下載芯片GSE43671，芯片平臺為GPL6294，其中包含18只NAION模型大鼠及18只空白對照組大鼠視網膜組織中的基因表達譜。利用R軟件(4.0.3)內的limma包對原始數據標準化數據、基因名稱注釋、構建表達矩陣等預處理。使用R語言中的WGCNA包對預處理后的基因表達譜進行加權基因共表達分析：(1)應用hclust函數對樣本聚類，剔除離群樣本；(2)應用pickSoftThreshold函數篩選合適的軟閾值以構建無尺度網絡，設定擬合指數為R2≥0.85；隨后，用blockwiseModules函數通過動態樹剪切算法對模塊聚類，要求最小簇基因數30個，合并相似模塊的閾值為0.25。

1.2特異性模塊識別與模塊內基因相關性分析對每個模塊進行主成分分析(principle component analysis, PCA)，將模塊特征基因值(module eigengene, ME)即模塊的第一主成分[5]與表型性狀相關聯，與性狀相關性R最高且P≤0.05的模塊即為組織特異性模塊，計算基因顯著性(gene significance， GS)和模塊成員(module membership, MM)，對模塊內基因進行篩選，范圍設置為MM>0.8且|GS|>0.2。

1.3富集分析使用R語言的clusterProfiler包對特異性模塊進行基因本體論分析(GO)和京都基因與基因組百科全書分析(KEGG)富集分析。以P<0.05表示富集的通路有統計學意義。

1.4篩選核心基因與miRNA預測將特異性模塊內符合篩選范圍的基因導入在線數據庫STRING(https://cn.stringdb.org/cgi/network.pl)，選擇綜合分數大于0.9的主要蛋白，構建蛋白互作網絡(proteinprotein interaction，PPI)，將結果導入Cytoscape軟件，使用軟件內cytohubba插件，基于最大集團中心性(maximal clique centrality, MCC)[6]篩選排名前10的關鍵基因。將獲得的關鍵基因導入TargetScan數據庫[7]預測靶向miRNA，用Cytoscape繪制miRNA-關鍵基因網絡圖。

2結果

2.1加權基因共表達模塊構建將高度設定為45，未發現離群樣本，納入所有樣本進行分析，見圖1A。當擬合指數R2為0.85時，選擇合適的軟閾值為9，見圖1B。使用動態剪切樹算法分割模塊并構建網絡圖，見圖1C，在GSE43671數據集中共識別出22個模塊，見圖1D。繪制模塊相關性熱圖，見圖2A，根據模塊與性狀間的相關系數選擇特異性模塊，22個模塊中藍色模塊相關性系數最高(cor=0.79,P<0.01)，見圖2B。計算藍色模塊內基因的|GS|和MM值并繪制散點圖，設置MM>0.8、|GS|>0.2對藍色模塊內的基因進行初步篩選，最終納入1380個基因進行后續關鍵基因的篩選。

圖1 WGCNA分析NAION相關模塊 A：樣本聚類；B：選定最佳軟閾值；C：基因共表達網絡分析，確定共表達數據模塊；D：各模塊特征與性狀間的相關系數，括號中的數字為相應的P值。

圖2 WGCNA分析NAION相關模塊 A：模塊聚類及相關性熱圖；B：GS與MM的相關性，cor為兩者間的絕對相關系數。

2.2富集分析將藍色模塊的全部1 958個基因納入分析，GO分析共得到富集分析通路130條，包括生物學過程(biological process, BP)93條、細胞組分(cellular component, CC)34條、分子功能(molecular function, MF)3條，排名前10的通路信息見表1；KEGG分析共富集得到通路18條，主要集中在神經信號傳遞通路、人乳頭瘤病毒感染通路、MAPK通路、PI3K/Akt通路等，排名前10的通路見表2，應用R語言GOplot包繪制GO分析可視化圖,ggplot2包繪制KEGG可視化圖(圖3)。

圖3 GO及KEGG富集分析圖 A：GO富集分析氣泡圖；B：KEGG富集分析氣泡圖；C：GO富集分析網絡圖。

表1 GO富集分析排名前10通路

表2 KEGG富集分析排名前10通路

2.3關鍵基因篩選及miRNA預測基于Cytoscape軟件中的cytohubba插件，關鍵基因為MCC算法排名前10的基因，分別為Psmb9、Psma7、Map3k14、Psme1、Nfkb1、Rela、Psma5、Relb、Psmb4、Nfkb2，共預測得到6個miRNA靶點，分別為rno-miR-383-5p、rno-miR-9a-5p、rno-miR-155-5p、rno-miR-223-3p、rno-miR-495、rno-miR-325-3p(表3)，使用R語言的ggcorrplot包繪制關鍵基因的相關性圖(圖4A)，表明關鍵基因間存在正相關關系，使用cytoscape軟件繪制miRNA-關鍵基因網絡圖(圖4B)。

圖4 關鍵基因分析及miRNA預測 A：關鍵基因相關性熱圖；B：關鍵基因-miRNA網絡圖。

表3 關鍵基因及miRNA預測

3討論

目前公認的NAION誘發因素為視盤血供灌注壓降低和危險視盤結構[8]，現已證實的血管危險因素包括高血壓、夜間低血壓、糖尿病等，同時可能與高脂血癥、貧血、吸煙、服用部分藥物等因素有關[9-10]。但目前NAION的病理機制尚未完全明確，且臨床上缺乏有效的治療藥物。因此，開展NAION分子機制的研究有助于NAION的治療。

與傳統的轉錄組差異基因分析方法相比，WGCNA算法能夠在基因相互關系的基礎上引入加權值，更充分地利用基因信息，從而構建出了更具有生物學意義的共表達網絡，更貼近生物體內的真實情況。本研究通過WGCNA方法分析GSE43671數據集，共獲得22個模塊，其中藍色模塊相關性最為顯著，對藍色模塊內基因進行GO與KEGG富集分析，結果顯示這些基因主要富集于MAPK通路、PI3K/Akt通路等。PI3K/Akt是經典的抗凋亡、促存活信號通路，也是保護視網膜神經節細胞(RGCs)功能的重要通路。有研究表明PI3K/Akt通路可以通過激活下游mTOR分子，通過調控自噬以保護視神經[11]。Husain等[12]學者研究表明PI3K/Akt通路可抑制RGCs的凋亡，其機制與促進下游NF-κB活化，引起其調控的促凋亡基因的凋亡有關[13]。MAPK信號通路包含ERK、JNK、SAPK以及P38 MAPK共4條途徑，在細胞增殖、炎癥、凋亡等多種生物過程中發揮重要調節作用。Foxton等[14]學者證明P38 MAPK介導了視網膜神經節細胞軸突遠端運輸丟失。Produit-Zengaffinen等[15]學者發現將JNK抑制劑注射進入缺血再灌注大鼠的玻璃體腔內，結果顯示RGCs凋亡率顯著下降。Yang等[16]證明MAPK通路級聯反應會打破軸突能量平衡，引起ATP減少以及鈣離子積累，最終激活鈣蛋白，使軸突破裂。以上實驗證明MAPK信號通路對NAION有重要作用。

通過cytohubba插件對特異性模塊內的基因進行篩選，得出關鍵基因，關鍵基因中Rela、Relb均為NF-κB蛋白的亞基，Nfkb1、Nfkb2則分別調控NF-κB蛋白的亞基P50與P52,NF-κB能夠在能量平衡、炎癥及凋亡中發揮多向性轉錄調節作用。Ando等[17]學者在體外實驗中證明NF-κB可降低RGCs的凋亡率。

miRNA是一類由21～24個RNA構成的非編碼蛋白單鏈RNA，其功能主要是將沉默的mRNA翻譯成蛋白質，以此調節細胞活動，其在調控基因表達、細胞周期、細胞增殖等生物過程中起到重要作用。本文通過Target Scan數據庫共預測到6個miRNA，其中部分miRNA在神經細胞的保護作用或其在眼科相關疾病中的作用已得到證實[18]。Wang等[19]學者通過實驗證明miR-155-5p可以促進Wistar大鼠的神經修復，其機制可能與cAMP/PKA通路有關；miR-9a-5p的上調可抑制ATG5介導的自噬活動[20]，減輕大腦中動脈閉塞導致的神經節細胞損傷；miR-495可以通過Gria2蛋白減輕神經元損傷[21]；miR-383可調控PI3K/Akt信號通路的表達，Jiang等[22]發現miR-383上調會上調PRDX3表達，引起高糖誘導的視網膜色素上皮細胞活力下降，導致細胞凋亡和活性氧形成。miR-325-3p在多種疾病的發展進程中起作用，有研究表明上調miR-325-3p可抑制血管內皮細胞焦亡[23]，過表達miR-325-3p可通過使MAPK通路失活來減少氧糖剝奪/復氧(OGD/R)誘導的神經元凋亡[24]。

綜上所述，本研究將WGCNA方法應用到NAION以研究其基因表達，并篩選獲得關鍵基因，構建miRNA-關鍵基因網絡，為研究NAION的發病機制和治療方法提供了新見解。但本研究同時也存在樣本量少且缺乏基礎實驗等不足之處，下一步還需進行動物實驗和細胞實驗加以驗證。