尿素解離試驗在減少新型冠狀病毒抗體假陽性中的應用價值

李小鳳，王 靜，張海燕，薛成軍，付 曉，羅 明，夏 云

WHO于2020年1月30日宣布新型冠狀病毒肺炎（coronavirus disease 2019, COVID-19）疫情為國際關注的全球突發(fā)公共衛(wèi)生事件，并于2020年2月28日將其風險程度評估從“高”上調至“非常高”[1]。此后，COVID-19在全球范圍內出現(xiàn)大流行。目前，COVID-19的實驗室診斷方法主要包括核酸檢測、抗體檢測和抗原檢測3種。基于反轉錄聚合酶鏈式反應（reverse transcription-polymerase chain reaction, RT-PCR）技術的核酸檢測方法是COVID-19診斷的金標準[2]，但采樣部位、采樣方式和病毒載量都會顯著影響核酸檢測的敏感度[3]。血清學試驗可有效檢測宿主針對病毒的免疫反應[4]，在一定程度上彌補核酸檢測的不足，但該方法往往受到其他冠狀病毒抗體或自身非特異性抗體潛在交叉反應的限制[5]。有研究發(fā)現(xiàn)，自身免疫性疾病（autoimmune diseases, ADs）患者血清的新型冠狀病毒（severe acute respiratory syndrome coronavirus 2, SARS-CoV-2）抗體檢測存在假陽性[6]。血清抗體檢測出現(xiàn)假陽性結果通常是由于自身抗體、嗜異性抗體或血清中的補體等與檢測試劑中的抗原非特異性結合所致。已有研究發(fā)現(xiàn)，尿素可作為抗原-抗體反應非特異性結合的解離物質[7]。本研究采用尿素對ADs患者的血清進行解離，評價其減少SARS-CoV-2 IgM/IgG抗體假陽性結果的效果，同時探討尿素解離試驗對COVID-19確診患者SARS-CoV-2 IgM/IgG抗體檢測結果的影響。現(xiàn)報告如下。

1 對象與方法

1.1 對象 選取2020 年2月1日—2021年2月28日在重慶市公共衛(wèi)生醫(yī)療救治中心和重慶醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院就診的350例患者和健康體檢者作為研究對象，其中ADs患者（自免組）200例，納入標準：①符合美國風濕病學會定義的ADs診斷標準[8-11]；②自身抗體陽性；③依據(jù)《新型冠狀病毒肺炎診療方案（試行第九版）》[12]的診斷標準，RT-PCR檢測SARS-CoV-2核酸為陰性，無COVID-19的流行病學接觸史、影像學及臨床實驗室指征。排除標準：①合并其他冠狀病毒感染；②既往感染SARS-CoV-2或接種SARS-CoV-2疫苗的患者。COVID-19患者（COVID-19組）100例，其中發(fā)病時間≤7 d 35例、8～14 d 31例、≥15 d 34例，納入標準：RT-PCR檢測SARS-CoV-2核酸陽性。排除標準：①合并其他冠狀病毒感染；②自身抗體陽性患者。健康體檢者（健康組）50例，所有健康體檢者RT-PCR 檢測SARS-CoV-2核酸均為陰性。本研究經(jīng)重慶市公共衛(wèi)生醫(yī)療救治中心倫理委員會批準實施（批件號：2020-079-KY）。

1.2 試劑和儀器 膠體金免疫層析法SARS-CoV-2 IgM/IgG 抗體檢測試劑盒購于英諾特生物科技有限公司。化學發(fā)光特異性SARS-CoV-2 IgM/IgG抗體檢測試劑盒和化學發(fā)光免疫分析儀均來自博奧塞斯公司。抗核抗體譜（IgG）檢測試劑盒（歐蒙印跡法）購自德國歐蒙有限公司。SARS-CoV-2 核酸檢測試劑盒購自達安生物科技股份有限公司。尿素購自sigma公司。

1.3 SARS-CoV-2 IgM/IgG抗體檢測 采集自免組、COVID-19組與健康組靜脈血，3500 rpm/min 離心10 min 后，取上層血清置于-80 ℃冰箱保存待測。采用膠體金免疫層析法檢測3組的SARS-CoV-2 IgM/IgG抗體，具體操作如下：向樣本孔中加10 μl血清樣本和2滴樣本稀釋劑，并在15～20 min內觀察T線（測試線）和C線（質控線）中的結果，陽性判斷標準：T線和C線位置同時出現(xiàn)肉眼可見的顯色條帶；弱陽性判斷標準：C線位置出現(xiàn)肉眼可見的顯色條帶比T線位置出現(xiàn)的顯色條帶顯著清晰；陰性判斷標準：僅C線位置出現(xiàn)出現(xiàn)肉眼可見的顯色條帶。COVID-19組中膠體金免疫層析法SARS-CoV-2 IgM/IgG抗體結果為弱陽性的標本，采用化學發(fā)光法復測SARS-CoV-2 IgM/IgG抗體。SARS-CoV-2核酸檢測采用RT-PCR技術。所有的檢測均嚴格按照試劑和儀器說明書操作。

1.4 尿素解離試驗 稱取一定質量尿素，用磷酸鹽緩沖液溶解配制不同濃度的尿素溶液（0、2、4、6、8、10 mol/L）待使用。所有SARS-CoV-2 IgM/IgG抗體陽性標本均進行膠體金免疫層析法尿素解離試驗，其中自免組SARS-CoV-2 IgM/IgG抗體陽性標本采用不同濃度尿素進行解離，COVID-19組SARS-CoV-2 IgM/IgG陽性抗體標本采用6 mol/L尿素進行解離。COVID-19組中膠體金免疫層析法SARS-CoV-2 IgM/IgG抗體結果為弱陽性的標本采用化學發(fā)光法復測后，進行尿素解離試驗，尿素濃度采用6 mol/L。

1.5 統(tǒng)計學處理 應用SPSS 21.0統(tǒng)計軟件分析處理數(shù)據(jù)，計量資料呈正態(tài)分布，采用±s 表示，組間比較采用F檢驗。計數(shù)資料以例（%）表示，組間比較采用四格表χ2檢驗或Fisher確切概率法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 基本情況 自免組患者200例，包含50例系統(tǒng)性紅斑狼瘡（systemic lupus erythematosus, SLE）患者、50例干燥綜合征（sjogren's syndrome, SS）患者、50例自身免疫性肝炎（autoimmune hepatitis, AIH）患者、50例混合性結締組織病（mixed connective tissue disease, MCTD）患者。其中男性22例，女性178例，年齡范圍19～87歲，平均年齡為（46.84±14.62）歲。COVID-19組患者100例，其中男性15例，女性85例，年齡范圍23～78歲，平均年齡為（43.28±15.49）歲。健康組50例，其中男性5例，女性45例，年齡范圍17～78歲，平均年齡為（43.20±15.90）歲，各組之間性別和年齡差異均無統(tǒng)計學意義（P均＞0.05）。見表1。

表1 3組患者基本資料比較（±s）Table 1 Comparison of basic data in 3 groups (±s)

表1 3組患者基本資料比較（±s）Table 1 Comparison of basic data in 3 groups (±s)

注：*. F值

項目 COVID-19組(n=100) 自免組(n=200) 健康組(n=50) F/χ2值 P值年齡 (歲 ) 43.28±15.49 46.84±14.62 43.20±15.90 0.229* 0.797性別[例(%)]1.231 0.540男15(15) 22(11) 5(10)女85(85) 178(89） 45(90)

2.2 健康組和自免組SARS-CoV-2 IgM/IgG抗體檢測結果 健康組SARS-CoV-2 IgM和IgG抗體特異度均為100%（50/50）。自免組SARS-CoV-2 IgM 和IgG抗體特異度分別為100%（200/200）和97%（194/200），其中6例SARS-CoV-2 IgG抗體陽性患者中，SLE患者3例，SS、MCTD和AIH患者各1例，且每例患者均存在抗核抗體（antinuclear antibody, ANA），其中2例患者僅ANA陽性，另外4例存在3種及以上自身抗體。

2.3 COVID-19組SARS-CoV-2 IgM/IgG抗體檢測結果 膠體金免疫層析法檢測COVID-19組SARSCoV-2 IgM/IgG抗體的敏感度分別為56%（56/100）和77%（77/100），IgM/IgG抗體總敏感度為85%（85/100）。

2.4 尿素解離試驗對ADs患者SARS-CoV-2 IgG抗體檢測結果的影響 不同濃度尿素解離6例SARS-CoV-2 IgG抗體陽性的ADs患者血清結果顯示：2 mol/L尿素解離后，1例SARSCoV-2 IgG抗體陽性者轉為陰性；4 mol/L尿素解離后，2例SARS-CoV-2 IgG抗體陽性者轉為陰性；6 mol/L、8 mol/L和10 mol/L尿素分別解離后，均有5例SARS-CoV-2 IgG抗體陽性者轉為陰性，即6 mol/L為最佳尿素解離濃度，其特異度為99.5%（199/200）。見表2。

表2 不同濃度尿素解離對ADs患者SARS-Cov-2 IgG抗體檢測結果影響Table 2 Effect of urea dissociation at different concentrations on the detection of SARS-CoV-2 IgG antibody in patients with ADs

2.5 尿素解離試驗對COVID-19患者SARSCoV-2 IgM/IgG抗體檢測結果的影響 COVID-19組中有36例患者SARS-CoV-2 IgG抗體呈弱陽性，6 mol/L尿素解離后，1例發(fā)病7 d內的患者SARS-CoV-2 IgG抗體轉為陰性，弱陽性標本轉陰率為2.78%（1/36），發(fā)病≥8 d的患者標本仍為陽性，SARS-CoV-2 IgG抗體弱陽性和陽性標本總體轉陰率為1.30%（1/77）。COVID-19組患者中有38例患者SARS-CoV-2 IgM抗體呈弱陽性，18例呈陽性，均未出現(xiàn)轉陰現(xiàn)象。膠體金免疫層析法檢出的SARS-CoV-2 IgM/IgG抗體弱陽性標本，經(jīng)6 mol/L尿素解離前后，用化學發(fā)光法檢測結果均為陽性。

3 討 論

自2020年COVID-19的全球大流行已造成數(shù)億人感染，并導致數(shù)百萬人死亡。國家衛(wèi)生健康委員會在《新型冠狀病毒肺炎診療方案（試行第七版）》[13]中首次提出COVID-19疑似病例具備血清SARS-CoV-2特異性 IgM抗體和IgG抗體陽性；血清SARS-CoV-2特異性IgG 抗體由陰性轉為陽性或恢復期較急性期 4 倍及以上升高作為確診病例。SARS-CoV-2特異性抗體血清學檢測具有準確、方便的特點，可用于監(jiān)測急性期COVID-19患者病情轉歸過程中的免疫狀況，也可用于評估健康人接種COVID-19疫苗后產(chǎn)生抗體的情況[14-15]。因此排除SARS-CoV-2特異性抗體檢測的干擾因素、消除假陽性，對COVID-19臨床診斷和疫情防控具有重要意義。

已有研究顯示，高類風濕因子（rheumatoid factor, RF）水平可能是導致SARS-CoV-2特異性抗體血清學檢測假陽性的重要因素[16]。本研究檢測200例ADs患者血清，SARS-CoV-2 IgM抗體均為陰性，6例SARS-CoV-2 IgG抗體為陽性，其中SLE患者3例，SS、MCTD和AIH患者各1例，與既往研究的結果一致[6]，說明自免組患者中容易出現(xiàn)SARS-CoV-2抗體假陽性問題。Aristov等[17]發(fā)現(xiàn)SARS-CoV-2棘突蛋白抗體和核蛋白抗體與線粒體、轉谷氨酰胺酶、核抗原、甲狀腺過氧化物酶、可提取核抗原和髓鞘堿性蛋白呈強反應性。同時，Aristov等[17]還發(fā)現(xiàn)5例血清SARS-CoV-2 IgG和IgM抗體均為假陽性的非COVID-19患者標本中有3例ANA、肌動蛋白和線粒體抗體顯著升高。由此推測，當人患ADs時，血液中的自身抗體與膠體金免疫層析法的硝酸纖維素膜包被的SARS-CoV-2抗原發(fā)生交叉反應是導致結果假陽性的可能原因。尿素作為一種解離劑，具有溶解和變性蛋白質的功能[18]。為尋找減少ADs患者假陽性結果的最佳尿素濃度，本研究采用不同濃度尿素對ADs患者SARS-CoV-2 IgG抗體陽性標本進行解離，結果發(fā)現(xiàn)隨著尿素濃度增加，SARSCoV-2 IgG抗體轉陰率在增加，但尿素濃度增加到6 mol/L、8 mol/L和10 mol/L時轉陰率均為83.33%，本研究將尿素6 mol/L作為最佳解離濃度并用于后續(xù)實驗，主要是基于有研究提示特異性抗原抗體親和力隨著尿素解離濃度的增加而降低[19]，因此，在同等效用下，選擇濃度較低者作為最佳解離濃度。

Benner等[20]發(fā)現(xiàn)COVID-19患者在感染早期，SARS-CoV-2 抗體的親和力較低，且隨著感染持續(xù)時間的延長而增加。由于COVID-19患者在發(fā)病不同階段其抗體的親和力會有所不同[19]，而尿素解離的效果與抗原抗體的親和力有關，由此推測尿素對各發(fā)病時期抗原抗體復合物的影響也可能有差異。本研究用尿素解離不同發(fā)病時間的COVID-19患者SARS-CoV-2 抗體陽性血清，發(fā)現(xiàn)1例發(fā)病7 d內患者SARS-CoV-2 IgG抗體由弱陽性轉為陰性，可能原因是親和力低，說明尿素對膠體金免疫層析法檢測早期確診患者抗體的敏感度可能存在一定的影響。張鵬等[21]發(fā)現(xiàn)化學發(fā)光法檢測SARS-CoV-2抗體的檢出率優(yōu)于膠體金免疫層析法，因此本研究將尿素運用到化學發(fā)光法中去檢測弱陽性標本，未發(fā)現(xiàn)SARS-CoV-2 IgM和IgG抗體轉為陰性。同時本研究存在一定的局限性，首先，納入研究ADs和COVID-19患者數(shù)量較少，其次，未研究尿素解離試驗減少SARSCoV-2特異性抗體假陽性結果的機制。

綜上所述，采用尿素解離試驗，可減少因抗原抗體交叉反應引起的假陽性問題，提高檢測的特異度，但該方法可能會降低COVID-19確診患者弱陽性SARS-CoV-2 IgG抗體的敏感度。