新型冠狀病毒肺炎無癥狀感染者的臨床與免疫學特征分析

申 川，秦 浩，馬路園，李星宇，宋枚芳，張云濤，高會霞，王 洋，戴二黑，趙彩彥

新型冠狀病毒肺炎（coronavirus disease 2019, COVID-19）是由嚴重急性呼吸綜合征冠狀病毒2型（severe acute respiratory syndrome coronavirus 2, SARS-CoV-2）引起的一種以病毒性肺炎為突出表現的全身感染性疾病。截至到2022年7月26日，已導致全球200個以上的國家和地區超過5.6億人感染，死亡人數達637萬人[1]，嚴重影響了全球社會經濟活動與人類的生活，也造成了巨大的經濟損失。COVID-19的疾病譜中除包括輕型、普通型、重型、危重型患者外，還存在一部分“無癥狀”感染者。這些感染者無明顯臨床癥狀，尤其在聚集性感染病例中較為常見，常通過密切接觸者篩查、聚集性疫情調查、傳染源追蹤調查發現，極易被忽視，且作為隱匿傳染源可造成疫情廣泛傳播。本研究通過分析河北省COVID-19救治定點醫院（石家莊市第五醫院）2020年1月22日—6月22日期間確診的COVID-19患者的臨床資料，初步探討COVID-19無癥狀感染者的臨床特征和宿主T淋巴細胞亞群、細胞因子/趨化因子譜的特征，完善對COVID-19疾病譜及致病機理的認識，為疫情防控提供理論依據。

1 對象與方法

1.1 對象 選取2020年1月22日—6月22日石家莊市第五醫院收治的59例COVID-19患者作為研究對象，同時選取24例健康者作為對照組。本研究通過河北醫科大學第三醫院（科2020-009-1）、石家莊市第五醫院（2020013）倫理委員會審核批準，所有研究對象均知情同意并簽屬知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 信息收集 收集59例COVID-19患者的人口學（年齡、性別等）資料、流行病學特征、臨床表現、胸部CT等臨床資料。

1.2.2 納入、排除標準 納入標準：參照《新型冠狀病毒感染的肺炎診療方案（試行第八版）》[2]，COVID-19患者須具有流行病學史，咽或鼻拭子SARS-CoV-2核酸檢測陽性，伴或不伴臨床表現、COVID-19胸部CT特征。排除標準：①疑似患者；②由其他病原體導致的肺部或全身感染、自身免疫性疾病、惡性腫瘤者；③無癥狀感染者應該排除入組時尚處于潛伏期而無癥狀，但隨疾病進展出現相應臨床表現的輕型、普通型、重型/危重型COVID-19患者。

1.2.3 患者分組 根據《新型冠狀病毒感染的肺炎診療方案（試行第八版）》[2]，將59例COVID-19患者分為4組：無癥狀感染組（n=28）、輕型組（n=6）、普通型組（n=19）、重型/危重型組（n=6）。無癥狀感染：核酸檢測陽性至核酸轉陰，自始至終不出現任何癥狀、體征和影像學表現。輕型：臨床癥狀輕微，影像學檢查未見COVID-19表現。普通型：具有發熱、呼吸道等癥狀，影像學檢查可見COVID-19表現。重型：符合以下情況之一者，①出現氣促，呼吸頻率≥30 次/min；②靜息狀態下，吸氣時指氧飽和度≤93%；③動脈氧分壓（PaO2）/吸氧濃度（FiO2）≤300 mmHg；④臨床癥狀進行性加重，胸部影像學顯示24～48 h內病灶明顯進展（＞50%）。危重型：符合以下情況之一者，①出現呼吸衰竭，且需要機械通氣；②出現休克；③合并其他器官功能衰竭，需ICU監護治療。因重型、危重型患者例數較少，故將其合并為重型/危重型組。

1.2.4 標本采集與處理 留取59例COVID-19患者EDTA-K2抗凝管靜脈血標本用于檢測T細胞亞群計數；留取59例COVID-19患者和24例健康對照者的促凝管靜脈血標本，分離血清后，置于-80 °C冰箱保存，檢測細胞因子和趨化因子水平。首次血液標本采集在入院48 h（治療前）內完成，根據臨床診治需要，部分患者同時采集入院第（14±2）d（治療后）血液標本。全部檢測均在符合生物安全要求的實驗室完成。

1.2.5 T細胞亞群計數檢測 取EDTA-K2抗凝血50 μl置于流式細胞管，加入 10 μl TriTESTCD3-PerCP/CD4-FITC/CD8-PE抗體，室溫避光溫育15 min，加入溶血素2 ml，溫育15 min后離心，PBS洗滌2次，用FACS-Canto II流式細胞儀（美國BD公司）檢測T細胞亞群計數。

1.2.6 血清細胞因子和趨化因子檢測 用Procarta Plex多細胞因子檢測系統（美國Thermo Fisher公司）檢測血清中25種細胞因子：IFN-α、IFN-γ、TNF-α、TNF-β、IL-1α、IL-1RA、IL-1β、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-9、IL-10、IL-12p70、IL-13、IL-15、IL-17A、IL-18、IL-21、IL-22、IL-23、IL-27、IL-31、 粒 細 胞 -巨噬細胞集落刺激因子（granulocyte macrophage colony stimulating factor, GM-CSF）及9種趨化因子：IL-8、干擾素誘導蛋白10（interferoninducible protein-10, IP-10）、嗜酸性粒細胞趨化因子（Eotaxin）、生長調節致癌基因（growthrelated oncogene, GRO）-α、單核細胞趨化蛋白-1（monocyte chemotactic protein 1, MCP-1）、巨噬細胞炎性蛋白（macrophage inflammatory protein, MIP）-1α、MIP-1β、基質細胞衍生因子（stromal cell derived factor, SDF）-1α、調節激活正常T細胞表達和分泌的趨化因子（regulated upon activation normal T-cell expressed and secreted, RANTES）的水平。具體方法為：將50 μl磁珠加入微孔板，離心棄去液體后，每孔加入25 μl緩沖液和25 μl樣品或標準品，室溫反應60～120 min，清洗微孔板2次，加入25 μl檢測抗體混合液溫育30 min后洗滌，再加入鏈霉親和素-熒光色素偶聯物溫育30 min。采用LuminexTM200流式熒光檢測儀讀取數據。

1.3 統計學處理 用SPSS 26.0軟件進行統計分析。計數資料以例數（%）表示，組間比較采用χ2檢驗。呈正態分布的計量資料以±s 表示，呈偏態分布的計量資料以M（P25，P75）表示，多組間總體差異比較采用Kruskal-Wallis H檢驗，組間比較采用Bonferroni法校正。配對設計采用Wilcoxon符號秩和檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 人口學數據和臨床特征 59例COVID-19患者中，男性37例，女性22例，年齡31.0（22.0，49.0）歲；各組患者性別比較差異無統計學意義（χ2=0.716，P=0.869）。各組患者年齡比較，差異具有統計學意義（H=17.787，P=0.001），其中無癥狀感染組[23.0（19.3，34.8）歲]顯著低于普通型組[35.0（24.0，52.0）歲]和重型/危重型組[64.5（52.0，68.3）歲]（P均＜0.05），而與輕型組[25.0（21.0，46.3）歲]比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。無癥狀感染組患者均無臨床癥狀和特異性胸部CT病變，而普通型組、重型/危重型組具有不同程度的發熱、乏力及呼吸道癥狀等，且至少存在累及1個肺葉的影像學改變。所有COVID-19患者均康復出院，無死亡病例，見表1。

表1 COVID-19患者的臨床特征（例）Table 1 Clinical characteristics of patients with COVID-19 (cases)

2.2 各組COVID-19患者治療前T細胞亞群計數的比較 所有COVID-19患者入院首次T細胞亞群檢測結果顯示：無癥狀感染組10例（35.7%）、輕型組0例、普通型組13例（68.4%）、重型/危重型組6例（100%）患者的CD4+T細胞計數低于正常值下限（參考范圍：550～1440個/μl）；無癥狀感染組3例（10.7%）、輕型組0例、普通型組2例（10.5%）、重型/危重型組5例（83.3%）患者的CD8+T細胞計數低于正常值下限（參考范圍：320～1250個/μl）。無癥狀感染組外周血CD4+T細胞、CD8+T細胞計數均顯著高于重型/危重型組（P均＜0.05），與輕型組比較差異均無統計學意義（P均＞0.05），無癥狀感染組CD4+T細胞計數顯著高于普通型組（P＜0.05），見表2。

表2 各組COVID-19患者治療前T細胞亞群計數的比較[M（P25，P75）]Table 2 Comparison of T-cell subsets in patients with various types of COVID-19 before treatment [M (P25, P75)]

2.3 各組COVID-19患者治療前與治療后T細胞亞群計數差值的比較 無癥狀感染組14例、普通型組13例、重型/危重型組6例患者在入院后第（14±2）d進行了第2次外周血T細胞亞群檢測。與治療前相比，治療后無癥狀感染組4例（28.6%）、普通型組11例（84.6%）、重型/危重型組4例（66.7%）患者CD4+T細胞計數升高；無癥狀感染組8例（57.1%）、普通型組10例（76.9%）、重型/危重型組5例（83.3%）患者CD8+T細胞計數升高。14例無癥狀感染組患者治療前與治療后CD4+T細胞和CD8+T細胞計數比較，差異均無統計學意義（P均＞0.05），見表3。普通型組、重型/危重型組治療后CD4+T細胞、CD8+T細胞計數均較治療前有不同程度的回升，但僅CD4+T細胞計數在上述2組中的上升幅度顯著高于無癥狀感染組的變化幅度，差異具有統計學意義（P均＜0.05），見表4。

表3 14例無癥狀感染者治療前和治療后T細胞亞群計數的變化[M（P25，P75）]Table 3 Changes of T cell subsets in 14 asymptomatic infected patients before and after treatment [M (P25, P75)]

表4 各組COVID-19患者治療前后T細胞亞群計數差值的比較[M（P25，P75）]Table 4 Comparison of T cell subpopulation count differences between patients with various types of COVID-19 before and after treatment [M (P25, P75)]

2.4 各組COVID-19患者治療前細胞因子和趨化因子表達譜的比較 無癥狀感染組24例、普通型組15例、重型/危重型組6例患者和24例健康對照者進行了外周血細胞因子和趨化因子的檢測。統計發現，在34種細胞因子和趨化因子中，23種在COVID-19患者及健康對照者中不能被檢測到，故未進行統計學分析。不同臨床分型COVID-19患者及健康對照者的血清細胞因子和趨化因子水平見圖1。無癥狀感染組血清IL-7水平顯著高于對照組（P＜0.05），雖低于普通型組、重型/危重型組患者，但差異均無統計學意義（P均＞0.05）。無癥狀感染組血清IP-10水平均顯著低于普通型組、重型/危重型組（P均＜0.05），但與對照組相比，差異無統計學意義（P＞0.05）。

圖1 各組COVID-19患者和對照組血清11種細胞因子和趨化因子水平直條矩形柱代表中位數，誤差線代表四分位數間距；Kruskal-Wallis H檢驗比較多組間總體差異，IL-7：H=10.230，P=0.017；IL-8：H=1.101，P=0.777；IL-18：H=2.293，P=0.514；Eotaxin：H=2.152，P=0.411；GRO-α：H=2.797，P=0.424；IP-10：H=18.355，P=0.001；MCP-1：H=2.703，P=0.440；MIP-1α：H=2.271，P=0.518；MIP-1β：H=3.777，P=0.287；SDF-1α：H=7.393，P=0.060；RANTES：H=2.002，P=0.672；a. 與對照組比較，P＜0.05；b. 與普通型組比較，P＜0.05；c. 與重型/危重型組比較，P＜0.05Figure 1 Serum levels of 11 cytokines and chemokines in patients with COVID-19 in each group and control group

3 討 論

COVID-19無癥狀感染者是指沒有可以自覺感知的相關臨床表現如發熱、咳嗽、咽痛或可以臨床識別的癥狀和體征，而從呼吸道等標本中檢測出SARS-CoV-2核酸陽性的一組人群[3-4]。研究發現，2020年COVID-19疫情早期時無癥狀感染者的占比在1.6%～59.0%之間[5-6]；2021年廣州暴發的德爾塔變異株疫情，無癥狀感染者占比為4.6%[7]；2022年上海奧密克戎變異株疫情中，無癥狀感染者高達90%以上[8]。這提示隨著SARS-CoV-2病毒株的不斷進化，病毒毒力下降，加之疫苗的廣泛接種后形成免疫屏障，無癥狀感染者成為最主要的感染類型。無癥狀感染者因具有高度的隱匿性，早期識別困難，常在密切接觸者篩檢、聚集性疫情調查、對有境內外SARS-CoV-2持續傳播地區旅行或居住史的人員開展主動核酸檢測時發現，因此探索無癥狀感染者的臨床及免疫學特征，有助于及時發現和遏制疫情傳播。

本研究顯示，COVID-19無癥狀感染者主要集中在青年人群，較少伴有基礎疾病，而普通型主要為中青年患者，重型/危重型更多見于老年患者，提示COVID-19的嚴重程度有年齡分布差異，這與其他一些研究的結果一致[9-11]。老年患者因免疫防御功能障礙、免疫衰老、發生免疫病理損傷的風險增高，使其發生重型、危重型COVID-19病例的比例顯著增高，并導致較高的病死率[12]。而年輕患者的T細胞和B細胞功能較強，能更好地控制病毒復制，同時減輕機體的炎癥反應，使得患者未出現臨床癥狀[13]。世界衛生組織的報告顯示全球70萬例COVID-19患者的男女比例為1.03:1，而本研究也未發現COVID-19嚴重程度存在性別差異。

既往研究證實，潛伏期無癥狀感染者與持續無癥狀感染者具有不同的免疫表型，如CD8+初始T細胞、CD107alow經典單核細胞、過渡型單核細胞等亞群比例降低，并存在單核細胞過渡活化和分化抑制現象，提示2種“無癥狀”具有截然不同的進展方向[14]。本研究在納入無癥狀感染者作為研究對象時，排除了處于潛伏期的COVID-19輕型、普通型、重型/危重型患者，只納入屬于持續無癥狀感染者，因此能真實反映該類型患者的免疫狀態。

宿主免疫功能是決定感染性疾病臨床轉歸的決定性因素之一。與前期一些研究結果相同，本研究也觀察到CD4+和CD8+T細胞計數在COVID-19患者中隨疾病進展明顯降低，尤其是CD4+T細胞更為顯著[11，15]。在SARS-CoV-2感染后，適應性免疫系統的輔助性T細胞、殺傷性T細胞及體液免疫的協同作用對疾病的預后和轉歸具有重要作用[16]。抗原特異性CD4+T細胞較CD8+T細胞介導的免疫應答對早期的病毒控制更為關鍵，無癥狀感染者被發現擁有更多具有功能性的抗原特異性CD4+T細胞[17]，因此與較快的病毒清除和較輕的臨床癥狀密切相關。同時，無癥狀感染者存在豐富的T細胞受體克隆，以及效應T細胞中干擾素刺激基因、細胞毒活性相關基因等的表達上調也對病毒的控制發揮重要作用[17-18]。本研究還發現，無癥狀感染者在治療前后外周血CD4+T細胞計數差值未見明顯上升甚至部分患者略有下降，這可能與免疫細胞上鞘氨醇-1及趨化因子受體的表達升高，促進免疫細胞向次級淋巴組織及肺組織遷移有關，從而有利于肺部SARS-CoV-2的清除同時避免嚴重的免疫炎癥損傷[17]。

COVID-19危重型患者常出現免疫的過度激活、細胞因子風暴，表現為血清中多種細胞因子水平的顯著增加，如IL-2、IL-6、IP-10、IP-10/CXC-10、MCP-1/CCL-2、GM-CSF、MIP1α/CCL3和TNF-α等[19]。這種過度的免疫反應導致免疫損傷，引起多器官功能障礙甚至衰竭死亡。但無癥狀感染者的細胞因子表達譜的特點在不同研究中差異較大[20]。本研究共檢測34種細胞因子和趨化因子，發現COVID-19患者外周血IL-7和IP-10水平明顯升高，且變化趨勢隨疾病嚴重程度遞增。IL-7的產生相對恒定，其水平主要由T細胞消耗控制，外周血IL-7水平的升高預示著T細胞庫的消耗，實質是對淋巴細胞減少產生的負反饋[21]，故重型/危重型患者升高幅度最大。IP-10屬于趨化因子CXC家族，可以通過激活機體免疫系統抵抗病毒抑制病毒復制。IP-10在單核巨噬細胞、活化的成纖維細胞、內皮細胞、淋巴細胞等多種免疫細胞表達，具有趨化炎癥細胞、促進炎癥因子釋放、參與機體免疫調節等功能。與既往的研究結果一致，IP-10在COVID-19重型/危重型患者中顯著升高，但在無癥狀感染者中未見明顯變化，提示IP-10與COVID-19疾病嚴重程度相關，是反映疾病進展的一種重要趨化因子[22]。

本研究尚具備一定的局限性，如樣本量偏小，尤其是輕癥、重癥、危重癥患者例數較少，可能使研究結果對上述臨床分型的代表性下降，同時因隨訪時間相對較短，未能觀察到SARS-COV-2不同分型感染者的遠期預后和轉歸。其次，因傳染病標本檢測的特殊性，本研究未能進一步對其他免疫細胞亞群（如B細胞、NK細胞、單核細胞等）、活化標記、效應功能等進行檢測。上述問題有待于更深入的研究進一步闡明。

綜上，COVID-19無癥狀感染者以青年為主，但未發現與性別因素相關。外周血T細胞亞群計數、細胞因子和趨化因子水平隨COVID-19嚴重程度而變化，但在無癥狀感染者中未見顯著改變，提示COVID-19無癥狀感染者通過適度的免疫應答實現SARS-CoV-2清除與避免免疫病理損傷的平衡。