漢灘病毒糖蛋白免疫反應性表位研究進展

孫報增，秦聰聰，康文龍，陳隆宇，謝明陽，毛自蕊，姜東伯，楊 琨

1 概 述

漢坦病毒（Hantaviruses, HV）是屬于布尼亞病毒科正漢坦病毒屬的負性RNA病毒，同時分為新、舊世界HV，前者包括引起腎綜合征出血熱（hemorrhagic fever with renal syndrome, HFRS（又稱流行性出血熱）的漢灘病毒（Hantaan virus,HTNV）、首爾病毒（Seoul virus, SEOV）、多布拉瓦-貝爾格萊德病毒、普馬拉病毒（Puumala virus, PUUV）; 后者包括引起漢坦病毒肺綜合征（Hantavirus pulmonary syndrome, HPS）的安第斯病毒和辛諾伯病毒[1]。HFRS的主要臨床特征是腎功能障礙和出血，而HPS的特征是急性呼吸衰竭。在中國，HFRS仍然被認為是嚴重的公共衛生問題，每年約有20 000～50 000例患者，病死率約為3%～10%[2]。

HTNV基因組由3個負鏈RNA片段組成：大（L）、中（M）和小（S）片段，分別編碼依賴RNA的RNA聚合酶、包膜糖蛋白（glycoprotein,GP）和核衣殼蛋白[3]。漢坦病毒GP是一個保守序列，宿主蛋白酶切割該序列產生N-末端糖蛋白（glycoprotein N-terminal, Gn）和C-末端糖蛋白（glycoproteinC-terminal, Gc）[4]，而Gn和Gc已被證明是保護性中和抗體反應的主要靶標[5]。HTNV滅活疫苗存在免疫反應不理想、保護作用不足等問題，甚至可能引起各種安全問題[6]。如今，研究更多基于HTNV GP的免疫反應性，借此來設計出強保護效力的新型HTNV疫苗。

表位是存在于抗原表面的、決定抗原特異性的特殊性結構的化學基團，又稱為抗原決定簇?？乖ㄟ^抗原表位與相應淋巴細胞表面抗原受體結合，從而激活淋巴細胞，引起免疫應答。因此，表位是被免疫細胞識別的靶結構，也是免疫反應特異性的基礎，其數量、性質和空間構型決定著抗原的特異性。近年來，國內外學者發現了HTNV GP上表位的重要性，對其展開了充分且有意義的研究。在此，本文對近年來國內外關于HTNV GP表位的研究進展進行簡要總結。

2 HTNV GP優勢表位的研究方法

2.1 通過鑒定T細胞抗原表位多肽活性來篩選表位 近年來，為了篩選鑒定HTNV GP上的T細胞表位，常用酶聯免疫斑點試驗（enzyme linked immunospot assay, ELISpot）來檢測T細胞表位多肽活性，從而確定活性較高的表位即優勢表位。ELISpot可以在單細胞水平對抗體分泌細胞（antibody secreting cell, ASC）及細胞因子（cytokines, CK）分泌細胞進行檢測，是細胞免疫學研究中高敏感性的檢測方法，可以從20萬～30萬細胞中檢岀1個分泌該蛋白的細胞。同時，該方法能夠對抗原刺激后的活細胞進行功能性檢測。因其具有較髙的特異性、直觀可信度，并且易操作，所以被廣泛用于CK分泌細胞檢測或ASC測定中，在國際學術界也獲得了廣泛的認可[7]。Ma等[8]將HTNV GP上全部氨基酸序列合成281個表位，并且根據順序分成28個肽庫，用來刺激HFRS患者的外周血單個核細胞，然后對高活性肽庫中15肽表位進行單個表位的ELISpot分析，進一步篩選出20個免疫表位，即優勢表位。Jiang等[9-11]通過ELISpot對其新型靶向DNA疫苗細胞保護性免疫效力進行評價，同時鑒定出aa470-484 等多個9肽和15肽表位為優勢表位。

另一方面，對于免疫信息法篩選得出的表位，同樣可以鑒定其多肽活性來進行實驗驗證。Sun等[12]及Tang等[13]使用ELISpot對預測的優勢表位進行了驗證，證明了方法的可靠性以及細胞免疫反應性表位的有效性。Ma等[14]通過對不同表位肽疫苗組進行ELISpot來鑒定表位肽作為疫苗的有效性。

2.2 應用免疫信息學預測法來篩選T細胞表位 由于生物信息學的飛速發展，其在免疫表位上的應用研究更多的被開發出來。T細胞表位的預測研究始于對輔助性T細胞（helper T cell, Th）表位的預測，但對細胞毒性T淋巴細胞（cytotoxic T lymphocyte, CTL）表位預測的探索進展最快，研究最深入，預測最成功[15]。

目前，對Th表位和CTL表位親和力的預測，均有多個預測網站根據不同算法對HTNV GP表位的親和力進行預測評估。其中，CTL表位的預測多使用IEDB-recommended[16]（http://tools.iedb.org/mhci/）、SMMPMBEC[17]（http://tools.immuneepitope.org/mhci/）、NetMHCpan4.1[18]（http://www.cbs.dtu.dk/services/NetMHCpan/）、SYFPEITHI[19]（http://www.syfpeithi.de/bin/MHCServer.dll/EpitopePrediction.htm） 以 及Rankpep[20-21]（http://imed.med.ucm.es/Tools/rankpep.html）等預測網站進行親和力分析；Th表位的親和力預測多使用IEDB[16]（http://tools.iedb.org/mhcii/）、NetMHCIIpan3.2[22]（https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?NetMHCIIpan-3.2）、SYFPEITHI[19]（http://www.syfpeithi.de/bin/MHCServer.dll/EpitopePrediction.htm） 和Rankpep[20-21]（http://imed.med.ucm.es/Tools/rankpep.html）等預測網站。Sun等[12]預測在高頻人群HLA基因型中GP全長中9肽和15肽的免疫親和力，使用上述多個網站多種算法評估親和力，選擇共有的高親和力表位，從而增加親和力預測的準確性。

然而，高親和力表位不一定具有強免疫原性，Vaxijen-2.0[23]（http://www.ddg-pharmfac.net/vaxijen/VaxiJen/VaxiJen.html）工具可以對腫瘤、病毒和細菌抗原進行免疫原性的預測。通過使用該工具，篩選出一批強免疫原性的抗原表位。

HTNV自從被發現以來，在歐亞大陸的不同地區已經發現眾多變異株。BLASTP （https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/ Blast.cgi）工具可以對給定抗原在一定范圍內進行種間種內保守性評估。ClustalX2.1工具也可以對不同毒株的糖蛋白序列進行比對，通過WebLogo對結果進行呈現。Sun等[12,24]在其研究中將HTNV 76-118株與137種變異株的高親和力區段進行比對，展現了部分GP表位上的高頻率突變位點。

通過以上免疫生物信息學的分析，最終獲得高親和力、強免疫原性和種間種內保守的優勢表位。免疫原性分析及保守性分析，成功篩選出高親和力、強免疫原性和種間種內保守的HTNV GP上9肽和15肽優勢表位[12，24]。使用該預測分析程序，能夠降低單一親和力算法所帶來的誤差，免疫原性分析使篩選出的抗原肽具有強免疫原性，同時保守性分析能夠使篩選的表位具有廣泛變異株適用性，從而篩選出具有廣泛地區人群適用性的HTNV GP表位。

2.3 表位肽掃描技術和噬菌體展示肽庫技術用于探索B細胞表位 上述方法在發現HTNV GP的T細胞表位中已得到充分使用及推廣。由于HTNV的清除依賴于細胞免疫的功能，因此過去數十年間大多數研究注重于針對T細胞表位。而體液免疫功能在長期免疫中起著重要的作用[25]。因此，早期部分學者將研究方向放在B細胞表位上以探究增強HTNV感染后的體液免疫，從而達到對HTNV感染長期免疫的效果。

表位肽掃描技術（peptide scanning technique,Pepscan）是研究B細胞表位的主要方法，利用合成肽對蛋白質進行表位作圖，即已知蛋白質抗原分子的基因序列，合成或表達連續的重疊短肽，通過與相應的單克隆抗體（單抗）或多克隆抗體（多抗）反應，分析檢測結果以確定相應的抗原表位[26]。Yan等[27]使用Pepscan方法繪制了3D8單克隆抗體識別的GP表位，并且通過競爭性ELISA方法進一步證實了與3D8單克隆抗體結合的特異性。

早期研究還使用噬菌體展示肽庫技術來研究HTNV GP 中表位的體液免疫反應。其基本原理是將外源蛋白或多肽的基因與噬菌體外殼蛋白基因融合，以融合蛋白的形式在噬菌體表面表達出多肽序列，并保持特定的空間構象，利用特異性親和作用來篩選特異性蛋白或多肽的一項新技術[15]。具體過程為將單抗包被至聚乙烯平皿后，加入噬菌體展示肽庫，使其與單抗充分反應后，洗去未結合的游離噬菌體，再用洗脫液將結合狀態的噬菌體洗脫下來。將其浸染宿主大腸桿菌進一步擴增后回收，再進行下一輪篩選。通常經過3～4輪的篩選，并且每次增加篩選強度，這樣就可獲得與單抗結合較緊密的噬菌體克隆。通過序列測定和分析，即能推知該噬菌體克隆所攜帶的外源短肽序列，從而確定該單抗所針對的抗原表位。該方法已得到Wang等[28]的充分驗證，證明其能夠模擬HTNV抗原的表位，且表位的體液免疫反應性顯著增強。 Xin等[29]從噬菌體展示肽庫中鑒定出HTNV GP受體結合域的寡肽3G1。Larson等[30]使用該方法鑒定出中和表位，證明其通過β3整聯蛋白抑制HTNV的進入從而起到抗病毒作用。

2.4 肽-MHC四聚體技術 指將生物素標記在底物肽的賴氨酸殘基上，使得一個標記熒光素的鏈親和素與4個生物素標記的肽-MHC復合物結合形成四聚體，肽-MHC四聚體與抗原特異性的T細胞上的T細胞受體（T cell receptor, TCR）結合后，即可以通過流式細胞儀定量檢出體內抗原特異性CTL。這項技術通過對表位與T細胞特異性識別結合從而完成對表位的驗證，具有高靈敏性、高特異性和高穩定性等優點。Tang等[13]通過預測優勢表位后，合成表位肽-HLA-A*0201四聚體。染色結果發現，各表位特異性CD8+T細胞頻率在輕度HFRS患者中較高，提示HTNV感染后預測的表位可誘導保護性免疫反應。

3 HTNV GP優勢表位的應用研究進展

3.1 鑒定出具有細胞或體液免疫反應性/免疫反應性的表位 通過上述方法與研究，鑒定出一批具有強反應性、T/B細胞特異性的HTNV GP優勢表位，將T、B細胞優勢表位的氨基酸序列及鑒定方法進行整理匯總，如表1和表2所示。由此發現關于B細胞表位的研究較T細胞少，這可能與下面幾點相關：①約90% B細胞表位是構象表位，同時構象B細胞表位不一定來自連續的肽段[31-32]；②線性B細胞表位通常引發不與天然抗原交叉反應的抗體[32]；③ T、B細胞在發育過程中經過V、D、J基因片段的重排從而形成TCR庫和B細胞受體（B cell receptor repertoire,BCR）庫[33]，肽-MHC的結合形成了TCR庫，個體攜帶的特定MHC等位基因組成為TCR庫多樣性的來源[34]；而B細胞必須對大量外來抗原產生反應并且無TCR相似的限制性[35]，因此BCR庫進化出相當大的數量。

表1 B細胞優勢表位匯總Table 1 Summary of dominant B cell epitopes

表2 T細胞優勢表位匯總Table 2 Summary of dominant T cell epitopes

續表2

用不同方法得到的優勢表位結果存在部分氨基酸序列交叉，提示各種研究方法可互相證明其有效性。在T細胞表位研究中，生物信息學法分析表位結合ELISpot驗證所得到的優勢表位具有較高的可信度。同時，由于優勢表位并不是均勻分布的，由此可以得到GP免疫反應性熱點區域：B細胞優勢表位GP免疫反應性熱點區域為：aa443-466；T細胞優勢表位GP免疫反應性熱點區域為：aa21-39、aa145-180、aa193-211、aa257-303、aa445-484、aa622-632、aa737-765、aa781-799、aa805-851、aa933-947、aa961-979 和 aa1082-1098。每個熱點區域至少包含2個優勢表位，提示對熱點區域進行研究能夠更快速的分析出強免疫反應性表位。

3.2 表位的保守性研究 近期有研究報道了中國不同地區HTNV的遺傳多樣性和系統發育特征[36-37]，并且HTNV變異株的增加和傳播受嚙齒動物的數量和活動影響[38-39]。而表位的保守與否直接關系著其免疫效力的發揮，引起病毒免疫反應的保守表位可以增加保護性免疫的范圍。因此，表位特異性種間和種內保守性研究不僅檢查其對HTNV的反應性，還檢查了對不同種HV的交叉反應性[24]。Sun等[24]將保守性分析納入分析優勢表位的內容之一，對HTNV 76-118株的GP表位種間和種內保守情況進行探究。發現9肽表位的保守性較差，而15肽表位的保守性較為良好[12]。這可能與15肽表位與MHC-II類分子結合的靈活性有關。在此基礎上，通過比對HTNV 147種變異株GP氨基酸序列，對高親和力區域進行進一步的保守性分析，推導出在眾多HTNV 變異株中存在高頻率變異位點的表位的親和力更好，提示變異使表位的免疫反應性增強[12]。

3.3 種屬交叉反應性的探究 對HTNV 研究只能在感染病例和實驗動物之間進行，因此人們探究病毒抗原的種屬交叉免疫反應性旨在尋求一種可模擬出人體免疫反應的實驗動物。通過對親和力數據進行聚類分析后，有研究分別探索了15肽和9肽抗原的跨種屬交叉免疫反應性，均發現Balb/c小鼠對HTNV GP的免疫親和力和人的更相近，提示缺乏人源化HLA轉基因小鼠的情況下，Balb/c小鼠可能是研究實驗的有效替代物[12，24]。

3.4 優勢表位 用來疫苗研究以增強特異性體液或細胞免疫滅活HFRS疫苗已在亞洲廣泛用于人群接種，然而，在中和抗體效價、細胞免疫應答和長效免疫記憶方面存在不足，不能完全防止人類感染HTNV[40-42]。已有研究利用所發現的表位進行疫苗研究以特異性增強機體抗HTNV的能力。

Zhao等[43]構建了抗HTNV、SEOV和PUUV感染的多表位嵌合DNA疫苗，該合成基因編碼了25個顯性B細胞和T細胞表位，證明可誘導顯著的體液免疫和細胞免疫。Ma等[44]利用表位肽直接作為疫苗，對小鼠進行免疫后評價免疫保護效力，發現肽疫苗可誘導強烈的IFN-γ應答和有效的細胞毒性T細胞應答，證明肽免疫小鼠對HTNV的攻擊具有部分保護作用。Tang等[13]也利用發現的表位輔以佐劑形成疫苗，對HLA-A2.1/KbTg轉基因小鼠進行免疫程序，成功地建立了保護性CTL應答。上述研究有效的解決了現有滅活HFRS疫苗存在的問題，同時為新疫苗的研發提供了新的思路。

4 結 語

抗原表位是機體特異性免疫反應的基礎，利用抗原表位來設計疫苗已被認為是一種可行、有效且安全的策略。近年來，生物信息學策略得到充分運用，不僅在HTNV等出血熱病毒上得到充分運用[45-48]，對于廣泛流行的新型冠狀病毒也已有文章發表[49-52]。然而，由于機體內免疫應答機制的復雜性，使得鑒定的抗原表位不能完全反應體內的實際情況。同時，各個研究方法并沒有統一的標準，以及每個生物信息學算法上存在的缺陷[53]，使得獲得的優勢表位的免疫反應性結果還有待商榷，“新抗原的發現和驗證仍然是一個令人生畏的問題”[54]；而對于優勢表位發現后續的研究，似乎進入了一個“死胡同”，并沒有將表位展開進一步應用?，F有另外多項新型表位研究方法在其他領域已得到廣泛應用，如基于流式細胞術的細胞內細胞因子染色法，已應用于SARS-CoV-2表位[55]和癌細胞表位[56]等研究。因此，建立一套行之有效的用于生物安全防護和公共衛生領域的病原體表位評價體系迫在眉睫。利用各種預測評價方法獲得具有免疫反應性的優勢表位，可充分應用于疫苗研制、藥品開發、臨床診斷等領域。相信在各個領域的協同配合下，HTNV GP表位終將在預防和治療漢坦病毒上發揮出巨大價值。