靜脈血栓栓塞患者循環(huán)細(xì)胞外DNA 變化及其臨床意義

張?jiān)?路彩霞 董素敏 孫美蘭

1.石家莊市人民醫(yī)院心血管內(nèi)科二病區(qū)，河北石家莊 050011；2.河北省滄州中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院急診科，河北滄州 061000；3.河北省滄州中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院介入血管外科，河北滄州 061000；4.石家莊市人民醫(yī)院建安病區(qū)，河北石家莊 050011

靜脈血栓栓塞癥是指血液在靜脈中的不正常凝結(jié)，使靜脈管腔阻塞，導(dǎo)致靜脈回流障礙，主要包括肺血栓栓塞和深靜脈血栓栓塞，是繼腦卒中和心肌梗死后第三大常見的心腦血管疾病[1-2]。靜脈血栓栓塞癥發(fā)病隱匿，80%左右的患者臨床癥狀不明顯，有高誤診率、高漏診率的特點(diǎn)[3]，且血栓形成后極少數(shù)能自行消融，大多會(huì)逐漸演變?yōu)檠ㄐ纬珊筮z癥，長期影響患者的生活質(zhì)量，嚴(yán)重者可導(dǎo)致死亡[4-5]。因此，尋找靜脈血栓栓塞癥的有效評(píng)估指標(biāo)以指導(dǎo)臨床治療、改善預(yù)后是臨床亟須解決的問題。有研究發(fā)現(xiàn)，中性粒細(xì)胞外誘捕網(wǎng)與靜脈血栓栓塞有著密切的關(guān)系，其獨(dú)特的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)可為血栓的形成提供支架，促進(jìn)血栓形成[6]。而血漿中游離脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）是中性粒細(xì)胞外誘捕網(wǎng)的主要成分，有研究報(bào)道老年骨折深靜脈血栓栓塞患者的循環(huán)DNA 水平明顯高于骨折未并發(fā)深靜脈血栓栓塞患者[7]，提示循環(huán)DNA 可能在深靜脈血栓栓塞形成中有著重要作用。基于此，本研究采用熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）技術(shù)檢測靜脈血栓栓塞癥患者循環(huán)細(xì)胞外DNA 水平，并探討其與靜脈血栓栓塞癥病情嚴(yán)重程度的關(guān)系，旨在為臨床評(píng)估治療提供新方向。

1 資料與方法

1.1 一般資料

經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)審批后（批準(zhǔn)文號(hào)：201904-002），選取石家莊市人民醫(yī)院（以下簡稱“我院”）2019 年5 月至2021 年5 月收治的107 例靜脈血栓栓塞患者作為疾病組，同期選取我院體檢科110 名健康體檢者作為對照組。對照組男69 例，女41 例；年齡45～73 歲，平均（57.36±5.18）歲。疾病組男65 例，女42 例；年齡46～73 歲，平均（56.14±5.21）歲；肺血栓栓塞23 例，深靜脈血栓栓塞84 例，其中深靜脈血栓栓塞發(fā)生左下肢57 例、右下肢24 例、雙下肢3 例；合并冠心病10 例，合并高血壓36 例，合并糖尿病14 例。兩組性別、年齡比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。

納入標(biāo)準(zhǔn)：①疾病組符合深靜脈血栓形成[8]和肺栓塞診斷標(biāo)準(zhǔn)[9]；②對照組經(jīng)體檢確認(rèn)健康；③年齡18～75 歲；④患者及家屬對本研究知情并簽署知情書。

排除標(biāo)準(zhǔn)：①有腎衰竭、肝硬化等重大器官疾病；②患惡性腫瘤；③已使用過溶栓、抗凝類藥物；④有血液系統(tǒng)性疾病；⑤免疫性疾病及急性感染。

1.2 循環(huán)細(xì)胞外DNA 水平的檢測

血漿樣本的采集：于對照組體檢當(dāng)日、疾病組治療前采集空腹外周無菌靜脈血5 ml 于EDTA 抗凝采血管（北京科美信生物有限公司）中，將血樣置于TDL-5-A 低速離心機(jī)（上海儀天科學(xué)儀器有限公司）3 000 r/min離心15 min，離心半徑15 cm，棄去上層血清，再于TGL-16G 高速離心機(jī)（上海儀天科學(xué)儀器有限公司）中12 000 r/min 離心10 min，離心半徑15 cm，將血漿分裝為每管200 μl，統(tǒng)一儲(chǔ)存于-80℃冰箱中。

循環(huán)DNA 水平的測定：取以上200 μl 血漿樣本解凍，按照血漿DNA 提取試劑盒（美國Epigentek 公司，貨號(hào)：70404-20）的說明進(jìn)行操作提取DNA，加入180 μl 熒光染料工作液混勻，另取10 μl DNA 濃度測定試劑盒（北京索萊寶科技有限公司）提供的標(biāo)準(zhǔn)品溶液與190 μl 熒光染料工作液混勻。用Varioskan LUX 多功能酶標(biāo)儀（賽默飛世爾科技有限公司）進(jìn)行測定（激發(fā)光波長480 nm，發(fā)射光波長530 nm），根據(jù)建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線和標(biāo)準(zhǔn)品的熒光值計(jì)算出樣品中的游離DNA 濃度。

1.3 病情嚴(yán)重程度判定

肺血栓栓塞嚴(yán)重程度判定：采用CT 肺動(dòng)脈造影檢查，將動(dòng)脈阻塞程度＜25%、≥25%且＜50%、≥50%且＜75%、≥75%且＜100%、100%分別分為1～5 級(jí)，各級(jí)的分值分別為1～5 分，統(tǒng)計(jì)1～5 級(jí)阻塞程度的總分，計(jì)算肺動(dòng)脈指數(shù)（pulmonary artery index，PAOI），PAOI=（1～5 級(jí)阻塞程度的總分）/155。按照相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)[10]，根據(jù)PAOI 將肺血栓栓塞患者分為輕度組：PAOI＜30%；中度組：30%≤PAOI＜50%；重度組：PAOI≥50%。

深靜脈血栓栓塞嚴(yán)重程度判定[11]：血管腔沒有被壓扁者得2 分，部分壓扁者得1 分，完全被壓扁者得0 分；血管腔血流完全缺損者得2 分，部分出現(xiàn)缺損者得1 分，血流充盈者得0 分；頻譜形態(tài)出現(xiàn)明顯異常者得2 分，部分異常者得1 分，頻譜形態(tài)正常者得0 分。總分≤2 分為輕度，3～4 分為中度，≥5 分為重度。

1.4 觀察指標(biāo)

比較兩組血漿循環(huán)細(xì)胞外DNA 水平；比較疾病組不同嚴(yán)重程度患者血漿循環(huán)細(xì)胞外DNA 水平；分析循環(huán)細(xì)胞外DNA 水平與靜脈血栓栓塞嚴(yán)重程度的關(guān)系。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 26.0 軟件對所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，比較采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料采用例數(shù)和百分率表示，比較采用χ2檢驗(yàn)；采用Spearman 秩相關(guān)分析循環(huán)細(xì)胞外DNA水平與靜脈血栓栓塞嚴(yán)重程度的關(guān)系。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組血漿循環(huán)細(xì)胞外DNA 水平比較

疾病組血漿循環(huán)細(xì)胞外DNA 水平高于對照組（P＜0.05）。見表1。

表1 兩組血漿循環(huán)細(xì)胞外DNA 水平比較（ng/ml，）

表1 兩組血漿循環(huán)細(xì)胞外DNA 水平比較（ng/ml，）

2.2 疾病組不同嚴(yán)重程度患者血漿循環(huán)細(xì)胞外DNA水平比較

疾病組107 例靜脈血栓栓塞癥患者中，輕度栓塞51 例，中度栓塞43 例，重度栓塞13 例。三組循環(huán)細(xì)胞外DNA 水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。中度組和重度組循環(huán)細(xì)胞外DNA 水平均高于輕度組，重度組循環(huán)細(xì)胞外DNA 水平高于中度組（P＜0.05）。見表2。

表2 疾病組不同嚴(yán)重程度患者血漿循環(huán)細(xì)胞外DNA 水平比較（ng/ml，）

表2 疾病組不同嚴(yán)重程度患者血漿循環(huán)細(xì)胞外DNA 水平比較（ng/ml，）

注 與輕度組比較，aP＜0.05；與中度組比較，bP＜0.05

2.3 循環(huán)細(xì)胞外DNA 水平與靜脈血栓栓塞嚴(yán)重程度的關(guān)系

Spearman 秩相關(guān)分析結(jié)果顯示，循環(huán)細(xì)胞外DNA水平與靜脈血栓栓塞嚴(yán)重程度呈正相關(guān)（r=0.866，P＜0.05）。

3 討論

靜脈血栓栓塞癥對人類健康有著嚴(yán)重的威脅。據(jù)西方國家的相關(guān)統(tǒng)計(jì)，每16 秒就有一個(gè)人發(fā)生靜脈血栓栓塞，每年死亡人數(shù)超過80 萬人[12-13]。靜脈血栓栓塞患者癥狀表現(xiàn)輕重不一，缺乏特異性，目前多普勒超聲以無創(chuàng)、易行的特點(diǎn)在臨床中應(yīng)用最多，但不能動(dòng)態(tài)觀察血栓的形成情況[14-15]。肺動(dòng)脈造影是診斷評(píng)估靜脈血栓栓塞癥的金標(biāo)準(zhǔn)，但由于有創(chuàng)且需要使用造影劑，實(shí)際應(yīng)用時(shí)經(jīng)常會(huì)受到限制[16]。因此，尋找一個(gè)準(zhǔn)確、客觀的檢測指標(biāo)來評(píng)估靜脈血栓栓塞癥患者疾病嚴(yán)重程度是臨床上亟待解決的問題。

本研究中發(fā)現(xiàn)疾病組循環(huán)細(xì)胞外DNA 水平較對照組升高，提示循環(huán)細(xì)胞外DNA 水平與靜脈血栓栓塞的發(fā)生有關(guān)。循環(huán)細(xì)胞外DNA 是血漿中游離的雙鏈DNA，廣泛存在于人體的血液中，可促使凝血活化、誘導(dǎo)血小板發(fā)生聚集，并對纖維蛋白的溶解有抑制作用[17-18]。Jiménez-Alcázar 等[19]研究發(fā)現(xiàn)，老年靜脈血栓栓塞患者循環(huán)細(xì)胞外DNA 水平與健康者相比明顯升高，可作為老年靜脈血栓栓塞患者死亡率的預(yù)測因子。本研究結(jié)果與之相符，證實(shí)了循環(huán)細(xì)胞外DNA 水平和靜脈血栓栓塞的形成密切相關(guān)。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)靜脈血栓栓塞不同嚴(yán)重程度患者的循環(huán)細(xì)胞外DNA 水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P <0.05），中度組和重度組循環(huán)細(xì)胞外DNA 水平均高于輕度組，重度組循環(huán)細(xì)胞外DNA 水平高于中度組，且進(jìn)一步進(jìn)行Spearman 分析顯示循環(huán)細(xì)胞外DNA 水平與靜脈血栓栓塞嚴(yán)重程度呈正相關(guān)，提示循環(huán)細(xì)胞外DNA 水平可作為評(píng)估靜脈血栓栓塞嚴(yán)重程度的指標(biāo)。Klopf等[20]研究發(fā)現(xiàn)，中性粒細(xì)胞外誘捕網(wǎng)可活化內(nèi)皮細(xì)胞中的金屬蛋白酶，致使內(nèi)皮細(xì)胞損傷，進(jìn)而促進(jìn)血栓的形成。中性粒細(xì)胞外誘捕網(wǎng)與靜脈血栓栓塞的發(fā)生存在密切的關(guān)系，其參與血栓的形成主要跟凝血因子、內(nèi)皮損傷等有關(guān)，還能與血栓蛋白C 和調(diào)節(jié)蛋白結(jié)合，抑制蛋白活化參與血栓的產(chǎn)生[21-23]。Hashimoto等[24]在活動(dòng)性疾病患者中發(fā)現(xiàn)中性粒細(xì)胞-血小板聚集頻率增加，可導(dǎo)致高濃度地循環(huán)細(xì)胞外DNA，造成血栓的形成和發(fā)展。另有研究報(bào)道[25]，血漿中DNA 含量和與血栓形成密切相關(guān)的中性粒細(xì)胞外誘捕網(wǎng)標(biāo)志物的升高趨勢具有一致性，且具有微創(chuàng)性、標(biāo)本獲取方便等優(yōu)點(diǎn)。循環(huán)細(xì)胞外DNA 是中性粒細(xì)胞外誘捕網(wǎng)的骨架，可為血小板的黏附提供支架，并能促進(jìn)纖維蛋白的沉積，加固血液凝塊，誘導(dǎo)血液淤滯，其水平越高則反映血液凝滯越嚴(yán)重，進(jìn)而也提示了靜脈血栓栓塞也嚴(yán)重[26]。故建議臨床可通過檢測靜脈血栓栓塞癥患者循環(huán)細(xì)胞外DNA 水平來評(píng)估病情來指導(dǎo)臨床治療。

綜上所述，靜脈血栓栓塞患者循環(huán)細(xì)胞外DNA水平較正常人群異常升高，且與靜脈血栓栓塞嚴(yán)重程度呈正相關(guān)，隨疾病嚴(yán)重程度的增加而升高，提示循環(huán)細(xì)胞外DNA 水平可作為評(píng)估靜脈血栓栓塞嚴(yán)重程度的指標(biāo)。但目前循環(huán)細(xì)胞外DNA 的確切來源還存在一些爭議，在炎癥、創(chuàng)傷等疾病也能檢測到循環(huán)DNA 濃度的升高，容易造成假陽性，關(guān)于循環(huán)細(xì)胞外DNA 水平在靜脈血栓栓塞癥中的臨床意義還需長期深入研究。