全二維氣相色譜-質譜聯用技術解析房縣黃酒的揮發性成分

劉慧杰，王娟，王忠朝，黃明泉，劉永國*，吳繼紅，張璟琳

1(北京忠和房縣生物食品有限公司，湖北 十堰，442199) 2(中國輕工業釀酒分子工程重點實驗室(北京工商大學)，北京，100048)

黃酒是世界上三大古酒之一，也是我國的國酒[1]。房縣黃酒歷史悠久，起源于周、興盛于唐，封為“御酒”，故又稱“皇酒”[2]。《詩經》中有50多篇文字的記述與房縣先民種稻、釀酒、飲酒有關。如《國風·七月》中有“八月剝棗，十月獲稻。為此舂酒，以介眉壽”。表明早在3 000年前，房縣黃酒就融入了百姓的生產生活當中。此外，房縣黃酒是國家地理標志保護產品，其釀造工藝入選省級非物質文化遺產[2]。房縣黃酒的釀造以糯米、水為主要原料，經蒸飯，冷卻，加當地的小曲進行糖化發酵而成。主要有以下特色：(1)發酵過程不加麥曲，不加酵母，采用糖化回淋工藝；(2)使用當地特色小曲為糖化發酵劑，主要原料是稻米粉和辣蓼草；(3)不加焦糖色；(4)發酵結束即裝瓶銷售，無需存儲，即為新(鮮)黃酒。這些獨特的釀造工藝使其具有味甘、色清、氣香、力醇的特色。相比于紹興黃酒的麥香濃厚，房縣黃酒的米香更加突出。紹興黃酒的醇厚是因為紹興酒講究窖藏年份，而房縣黃酒講究鮮甜、綿長、爽口。然而，房縣黃酒目前仍停留于傳統粗放的生產方式，在許多生產環節憑借工人的經驗進行。由此產生生產效率低下、產品質量不穩定等問題，制約著房縣黃酒的產業發展。

風味是決定消費者接受度的關鍵因素，也是評價黃酒質量好壞的重要指標。解析黃酒的風味物質基礎對黃酒的風味品質調控有重要作用。目前中國大部分地區的黃酒風味成分都已有研究報道。如王培璇等[3]采用頂空固相微萃取結合氣相色譜-質譜聯用(head space solid-phase microextraction combined with gas chromatography-mass spectrometry, HS-SPME-GC-MS)從來自不同地區(江西、廣西、廣東、浙江、江蘇、安徽、福建、上海、山東、遼寧和山西)的12種黃酒中共檢測到142種揮發性物質。有學者采用不同的前處理結合香氣嗅聞(gas chromatography-olfactometry, GC-O)分析鑒定了紹興黃酒、福建黃酒、徽派黃酒、代縣黃酒中的重要香氣活性物質[4-9]。然而，關于房縣黃酒風味的研究仍然較少，僅晉湘宜等[10]采用同時蒸餾萃取(simultaneous distillation extraction, SDE)、固相微萃取(solid-phase microextraction, SPME)與液液萃取(liquid-to-liquid extraction, LLE)方法分析了房縣傳統型、洑汁型和清爽型黃酒的7種揮發性成分，包括乙酸乙酯、正丙醇、異丁醇、異戊醇、己酸乙酯、乳酸乙酯和β-苯乙醇。結果顯示傳統型和洑汁型黃酒風味物質含量最多，清爽型黃酒中各種風味物質含量相對較少。對于房縣黃酒風味成分還有待進一步研究。

本論文采用HS-SPME結合全二維氣相色譜-質譜聯用技術(comprehensive two-dimensional gas chromatography-mass spectrometry, GC×GC-MS)全面分析房縣洑汁、干型黃酒、甜型黃酒中的揮發性成分，旨在揭示房縣黃酒香氣成分的化學本質，為房縣黃酒的質量控制提供參考和科學依據，促進其產業發展。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

實驗樣品：房縣發酵3 d的洑汁、干型黃酒(原酒)、甜型黃酒(原酒)樣品，北京忠和房縣生物食品有限公司。

試劑：C6～C30正構烷烴(色譜純)，美國Supelco公司；4-辛醇(99.0%)，北京百靈威科技有限公司；NaCl(99.9%)，國藥集團化學有限公司。所有標準品純度大于90%，詳見附表1見電子版增強出版鏈接(https://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1802.TS.20220419.0928.006.html)。

1.2 儀器與設備

7890B-5977A氣相色譜-質譜聯用儀，美國安捷倫科技公司；SSM1800調制器，雪景電子科技(上海)有限公司；SPME萃取纖維(長2 cm，50/30 μm DVB/CAR/PDMS)、手動固相微萃取手柄，美國Supleco公司；DF-lO1S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器，鞏義市予華儀器責任有限公司；T-403電子天平，北京賽多利斯儀器系統有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 樣品前處理

6.0 μL 4-辛醇(1 000.0 mg/L)作為內標加入至用2.0 g NaCl飽和過的黃酒樣品中(6.0 mL)，并將混合液放入頂空瓶(20 mL)中，再將頂空瓶放入45 ℃水浴鍋中平衡30 min，插入2 cm灰色萃取頭(50/30 μm DVB/CAR/PDMS)萃取30 min，將萃取頭插入250 ℃的GC-MS進樣口，解析5 min。

1.3.2 感官評價

從實驗室招募15名具有感官評價經驗的小組成員，將黃酒樣品(5.0 mL)裝入以3位數字隨機編碼的酒杯(10.0 mL)中，并隨機呈遞給評價小組成員，要求評價人員使用6～10個詞匯描述黃酒樣品的香氣感官特征，然后根據描述詞匯的頻率高低確定黃酒的最終風味輪廓。最終米香、烤香、醇香、花香、果香、甜香、酸香、糟香和烤香9種香氣特征被確定為房縣黃酒的香氣輪廓，采用1～9分強度法對每個香氣輪廓的強度進行打分，其中設置1～3分為弱，4～6分為中等，7～9分為強，評價方法參考GB/T 19547—2004《感官分析 方法學 量值估計法》。

1.3.3 色譜條件

色譜柱：第一根色譜柱為J&W DB-WAX(60 m×0.25 mm×0.25 μm)；第二根色譜柱為J&W DB-17MS(1.0 m×0.18 mm×0.25 μm)；調制柱為C5～C30的HV系列。升溫程序：初溫50 ℃，保持3 min，再以6 ℃/min的速度升至240 ℃，并保持10 min；調制器：進口熱區溫度為初溫110 ℃，保持3 min，再以6 ℃/min升到300 ℃，保持10 min；出口熱區為170 ℃，保持3 min，再以6 ℃/min升至320 ℃，保持15 min；冷區溫度為-50 ℃；調制周期為4 s/1 s。載氣(He，99.999%)流速2.0 mL/min，不分流。

1.3.4 質譜條件

電子轟擊(EI)離子源；電子能量70 eV；傳輸線溫度250 ℃；離子源溫度250 ℃；質量掃描范圍m/z40～450。

1.3.5 定性分析

采用NIST14(National Institute of Standards and Technology)譜庫檢索(匹配度大于700)、保留指數(retention index，RI)和標準品比對進行定性分析。

RI定性[11]：在相同的色譜條件下，分別將樣品與正構烷烴(C6～C30)前后進樣進行分析，RI的計算如公式(1)所示，并與文獻報道的RI對比，將絕對值相差30以內的確定為同一化合物。

(1)

式中：n和n+1分別為未知化合物流出前后正構烷烴碳原子數；t為未知化合物保留時間；tn和tn+1為相應正構烷烴的保留時間(tn

1.3.6 定量分析

采用內標法定量，通過樣品中各組分的峰面積與內標峰面積的比值和樣品中各組分濃度與內標濃度比值，求得各揮發性成分的含量。

1.3.7 數據分析

采用Origin Pro 9.1進行雷達圖和柱狀圖的繪制；采用SPSS 22.0軟件進行單因素方差分析(鄧肯檢驗)；偏最小二乘法(partial least squares regression, PLSR)分析采用XLstat 2016；熱圖聚類分析采用TBtools v 1.082。

2 結果與分析

2.1 香氣感官評價分析

對發酵3 d的洑汁、干型黃酒和甜型黃酒定量描述性分析，結果如圖1所示。房縣黃酒的香氣主要為米香、醇香、花香、果香、甜香、酸香、糟香和烤香。對感官評價結果進行單因素方差分析發現，米香、醇香、花香在3個樣品中存在極顯著差異。發酵3 d的洑汁米香和甜香突出，干型黃酒有較強的花香和醇香，甜型黃酒的烤香、酸香、果香比較強烈。而紹興黃酒則是醇香、焦糖、果香、煙熏、曲香、藥香、蜂蜜香較為突出[4]；以黍米為原料的代縣黃酒的香氣以糟香、米香、蜂蜜、酸香、焦糖、醬香、醇香、陳香、曲香為主，其中糟香最濃[9]。相比之下，濃郁的米香、果香、花香形成了房縣黃酒的特色香氣。

2.2 揮發性成分定性分析

HS-SPME萃取是將石英纖維置于待測樣品上方的氣相中吸附揮發性成分，提取過程無需溶劑，集萃取、吸附、富集、洗脫和進樣于一體，提取過程快速、簡單[12]。對房縣發酵3 d的洑汁、干型黃酒原酒、甜型黃酒原酒進行了HS-SPME結合GC×GC-MS分析，結果如附表2(見電子版增強出版附件：https://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1802.TS.20220419.0928.006.html)，發酵3 d的洑汁、干型黃酒、甜型黃酒中共鑒定出205種揮發性成分，包括酯類63種、醇類46種、酸類10種、醛類17種、酮類25種、酚類5種、內酯類8種、縮醛9種、烯烴類9種、呋喃類5種、含硫類8種。其中，有85個化合物是首次在黃酒中被檢出，其中59個化合物經標準品定性。

如圖2所示，發酵3 d的洑汁樣品中共鑒定出139種揮發性成分，干型黃酒中鑒定出140種，甜型黃酒鑒定出137種。其中，3種黃酒共有的有82種，干型黃酒特有的有25種，甜型黃酒特有的有25種，發酵3 d的洑汁特有的有26種。在干型和甜型黃酒中都有，但發酵3d樣品中沒有的有16種；在干型和發酵3d中都有，但甜型黃酒中沒有的有17種；在甜型和發酵3d中都有，但干型黃酒中沒有的有14種。

圖2 三種不同房縣黃酒樣品的揮發性成分的 Venn圖分析結果Fig.2 Venn diagram analysis results of volatile components among three Fangxian Huangjiu

此外，由圖3可以看出，發酵3 d的洑汁中醛類、酮類、呋喃類和烯烴類化合物的數量最多；干型黃酒的酯類、醇類數量最多；甜型黃酒中酸類、內酯類最多；酚類在3種酒中一樣多，酮類和縮醛類的數量在干型和甜型黃酒中一樣多。

圖3 三種不同房縣黃酒中各類揮發性化合物的數量圖Fig.3 The number of various volatile compounds among three Fangxian Huangjius

值得注意的是，在房縣黃酒的揮發性成分中有23種物質據文獻報道有健康功效。包括4種酯類：乙酸乙酯能加速新陳代謝功能制約乙醛，乳酸乙酯可促進乙醇刺激大腦皮層的作用，使人興奮，己酸乙酯能降低肺火，穩定心肺的作用，亞油酸乙酯在體內水解后生成脂肪酸，可抑制膽固醇合成[13]；7種酸類：乙酸、丁酸、己酸、庚酸、辛酸、壬酸、癸酸是維持腸道和免疫穩態的主要參與者[14]；還有8種萜烯類及其衍生物具有抗癌，抗炎，抗病毒，抗氧化活性等保健或藥物作用[15]，其中伯克哈拉杜烯，石竹烯、蛇麻烯、(-)-α-依蘭油烯、δ-杜松烯、α-蓽茄醇、3,7,11-三甲基-2,6,10-十二碳三烯-1-醇都是首次在黃酒中被報道，D-檸檬烯只在小米和黍米黃酒中有報道[16-17]；此外，糠醇具有抗癌和抗氧化活性[18]；二甲基二硫是內源性抗氧化物，具有減少細胞氧化應激損傷和延長動物壽命的作用，可能在內源性抗氧化防御體系中扮演重要角色[19]；3-甲硫基丙醇具有抗氧化活性，還可抑制α-葡萄糖苷酶的活性，降血糖功能[20]；4-乙烯基愈創木酚有降低血糖、抗炎活性[13]。

2.3 揮發性成分定量分析

如附表2所示，發酵3 d的洑汁揮發性成分總相對含量最多(20 859.32 μg/L)，其次是干型黃酒(16 008.70 μg/L)和甜型黃酒(14 153.89 μg/L)。

黃酒中的醇類產生主要有2種途徑：一種是通過Ehrlich途徑由氨基酸轉化而來；另一種是通過糖酵解途徑合成(Harris途徑)[21]。在前期的研究中已有報道，3-甲基-1-丁醇(呈醇香和果香)和β-苯乙醇(呈甜香和花香)對黃酒的糟香和甜香有重要貢獻[9]。在房縣黃酒中，3-甲基-1-丁醇和苯乙醇都是在發酵3 d的洑汁中的含量(質量濃度為4 630.16和3 252.79 μg/L)高于干型黃酒(質量濃度為2 334.67和2 694.30 μg/L)和甜型黃酒(質量濃度為1 928.02和1 484.27 μg/L)。

酯類通常貢獻果香、甜香和花香[9]，主要由代謝過程中葡萄糖和氨基酸產生的醇與酸在酯酶催化下反應形成的[21]，在發酵3 d的洑汁、干型黃酒、甜型黃酒中酯類物質的質量濃度依次是4 716.39、5 089.56和4 896.41 μg/L。乙酸乙酯、乙酸異戊酯、乳酸乙酯、丁二酸二乙酯在紅曲黃酒中被鑒定為關鍵香氣成分[5]，乳酸乙酯在代縣黃酒中被鑒定為對糟香有顯著貢獻的成分[9]。乙酸乙酯在發酵3 d的洑汁中質量濃度最高，為1 224.28 μg/L，其次是干型黃酒(978.60 μg/L)，甜型黃酒中質量濃度最低(897.78 μg/L)；乙酸異戊酯的質量濃度在干型黃酒中最高(409.31 μg/L)；乳酸乙酯和丁二酸二乙酯的質量濃度在甜型黃酒中最高，分別是334.79和1 308.11 μg/L。這些化合物中，除了乙酸異戊酯的含量與紅曲黃酒(135.89～239.36 μg/L)相近，其他物質的含量均低于紅曲黃酒及紹興黃酒中的含量[5,8]，如在紅曲黃酒中乙酸乙酯質量濃度為7 605.07～1 639 960 μg/L、乳酸乙酯質量濃度為5 875 894～32 024 917 μg/L、丁二酸二乙酯質量濃度為150 101～12 371.54 μg/L[5]。這可能由于房縣黃酒是新鮮的黃酒，而其他地區的黃酒經過陳釀酯類物質含量增加[8]。

乙酸和3-甲基丁酸對黃酒的酸香有重要貢獻[8-9]。乙酸在發酵3 d的洑汁中質量濃度較高，為1 189.46 μg/L，其次是甜型黃酒971.71 μg/L，干型黃酒中質量濃度最低，為686.91 μg/L。3-甲基丁酸在發酵3 d的洑汁中質量濃度較高，為176 06 μg/L，甜型黃酒中質量濃度最低，為122.76 μg/L。乙酸和3-甲基乙酸在房縣黃酒中的含量低于紹興黃酒和黍米黃酒中的含量[8-9]。

在發酵過程中醛類物質大部分是通過氨基酸的脫氨和脫羧作用產生的[21]，大多數醛類物質呈青香，如壬醛、庚醛等[9]。有研究表明，壬醛對黃酒的熟糧香有重要貢獻[22]，壬醛在發酵3 d的洑汁中質量濃度(868.67 μg/L)高于干型黃酒(249.07 μg/L)和甜型黃酒(70.68 μg/L)。且壬醛在房縣黃酒中的質量濃度較高，如在紅曲黃酒中質量濃度僅為5.42～8.68 μg/L[5]，紹興黃酒中僅為21.9～27.7 μg/L[7]。據之前的研究報道，在紹興黃酒(150～5 560 μg/L)[8-9]、小米黃酒(415.21～11 226.44 μg/L)[14]、紅曲黃酒(783.7～1 263.7 μg/L)[5]中，苯甲醛是含量最高的醛類物質，呈苦杏仁味，它在房縣黃酒中的質量濃度為146.11～160.15 μg/L。此外，目前已報道對黃酒香氣有重要貢獻的醛類化合物還有香蘭素[8-9]，然而，香蘭素在房縣黃酒中并未被檢出。

縮醛類物質主要貢獻果香和甜香[8]。乙縮醛(呈果香)在甜型黃酒中的質量濃度882.73 μg/L高于發酵3 d的洑汁470.80 μg/L和干型黃酒371.21 μg/L，但它們的含量都低于紹興黃酒(15 800～134 000 μg/L)[8]。還有8種縮醛在黃酒中首次被報道，包括1,1-二乙氧基-2-甲基丙烷、2,4,5-三甲基-1,3-二氧戊環、1,1-二乙氧基-3-甲基-丁烷、1,1-二乙氧基戊烷、1,1,3-三乙氧基丙烷、1,1-二乙氧基-壬烷、1,1-二乙氧基癸烷、(2,2-二乙氧基乙基)苯。因此，可推測房縣黃酒中豐富的縮醛類化合物可能也是造成其果香、甜香突出的重要因素之一。

此外，對黃酒香氣影響較大的還有酚類(159.55～429.14 μg/L)、內酯類(17.02～165.90 μg/L)和含硫類化合物(159.55～429.14 μg/L)[8-9]。酚類物質主要呈煙熏味、木香等，主要來源于羥基肉桂酸、阿魏酸和對香豆酸的脫羧反應[21]。房縣黃酒中檢出苯酚、4-乙基苯酚、4-乙基愈創木酚、4-乙烯基愈創木酚、2,4-二叔丁基苯酚，這些物質在紹興黃酒和福建紅曲黃酒中都有報道[5,8-9]。據陳雙[4]報道，4-乙烯基愈創木酚在紹興黃酒中被鑒定為重要的香氣活性物質，貢獻木香和煙熏味，質量濃度在125～2 750 μg/L，然而，4-乙烯基愈創木酚在房縣發酵3 d的洑汁中質量濃度僅為32.99 μg/L，在甜型和干型中質量濃度更低，分別為7.35和1.53 μg/L。這與感官評價結果一致，紹興黃酒中有較濃的煙熏味，而房縣黃酒中幾乎感受不到該香氣。

內酯類物質主要來源于美拉德反應和發酵過程中的酵母代謝[23]，主要貢獻黃酒中的焦糖香和甜香。在之前的研究中，呈奶香的γ-壬內酯和呈焦糖味、藥香的葫蘆巴內酯在紹興、代縣等地區的黃酒中是最重要的內酯類化合物[8-9]，被鑒定為關鍵香氣成分。γ-壬內酯在房縣黃酒中的質量濃度為10.73～13.99 μg/L，低于浙江(250.16 μg/L)[24]、上海(57.36 μg/L)[24]、代縣(52.59 μg/L)[9]等地區的黃酒；然而，葫蘆巴內酯在房縣黃酒中未被鑒定出。這與感官評價結果一致，房縣黃酒中幾乎沒有焦糖味和藥香，這可能由于房縣黃酒是新鮮的黃酒，而葫蘆巴內酯是黃酒在陳釀過程中產生的[8]。

含硫類化合物由于其較低的閾值，對食品的香氣有重要貢獻。3-甲硫基-1-丙醇呈典型的煮土豆味，在發酵3 d的洑汁中的質量濃度為129.04 μg/L，大于干型黃酒(94.06 μg/L)和甜型黃酒(56.30 μg/L)。與紹興黃酒4 233.06～31 069.19 μg/L[8]、代縣黍米黃酒652.04 μg/L[9]和小米黃酒258.17～334.82 μg/L[13]等相比，3-甲硫基-1-丙醇在房縣黃酒中的含量較低。

2.4 香氣與揮發性骨架成分相關性分析

為了明晰房縣黃酒揮發性骨架成分與香氣特征的關系，選取在3個樣品中質量濃度最大的30種揮發性成分與香氣屬性做PLSR相關性分析。變量投影重要性(variable importance in projection，VIP)>1.0的化合物可認為是導致樣品間差異的重要因素[25]。如圖4所示，乙酸乙酯、壬醛、3-甲基-1-丁醇、1-丙醇、乙酸苯乙酯、2-甲基-1-丙醇、3-甲基丁酸、4-乙基苯酚、1-辛烯-3-醇、丙酸乙酯、3-甲基丁醛、3-甲硫基-1-丙醇、β-苯乙醇、乳酸乙酯、丁二酸二乙酯的VIP>1.0，說明它們是潛在的導致不同類型房縣黃酒香氣差異的重要化合物。

圖4 揮發性骨架成分在3個樣品間的變量投影重要性Fig.4 Variable importance in projection (VIP) of volatile skeleton components among three Fangxian Huangjius

此外，將骨架成分與香氣特征的相關系數進行聚類分析，結果如圖5所示，紅色表示正相關，藍色表示負相關，圓圈越大表示相關系數越大。可見，β-苯乙醇、3-甲硫基-1-丙醇、丙酸乙酯、3-甲基丁醛、1-辛烯-3-醇、4-乙基苯酚、乙酸乙酯、壬醛、3-甲基-1-丁醇、1-丙醇、3-甲基丁酸、2-甲基-1-丙醇、乙酸苯乙酯與米香和甜香呈顯著正相關，而與其他香氣呈負相關。另外，丁二酸二乙酯、乳酸乙酯、乙酸異戊酯、4-辛酮、十五酸乙酯與酸香、果香、糟香、醇香呈顯著正相關，而與米香和甜香呈負相關。其中，β-苯乙醇、乳酸乙酯、乙酸異戊酯、乙酸乙酯、3-甲基-1-丁醇、3-甲基丁酸在前期報道中已被證實為黃酒中的關鍵香氣成分[5,8-9]。且已有研究表明β-苯乙醇呈典型的甜香和花香，對黃酒的甜香有顯著貢獻；乳酸乙酯雖然閾值高，但對糟香有顯著貢獻。這都與本研究結論一致。值得注意的是，丁二酸二乙酯僅在房縣甜型黃酒中含量較高且與酸香、果香、糟香、醇香呈顯著正相關，因此，丁二酸二乙酯在房縣黃酒中的作用值得進一步研究。

圖5 感官特征和揮發性骨架成分相關性熱圖Fig.5 Heat map analysis of the correlation between the sensory characteristics and main compounds

3 結論

本研究采用感官評價和HS-SPME結合GC×GC-MS鑒定出房縣發酵3 d洑汁、干型黃酒、甜型黃酒中205種揮發性成分。發酵3 d的洑汁揮發性成分的含量最多，其次是干型和甜型黃酒。相關性分析發現，β-苯乙醇、3-甲硫基-1-丙醇、丙酸乙酯、3-甲基丁醛、1-辛烯-3-醇、4-乙基苯酚、乙酸乙酯、壬醛、3-甲基-1-丁醇、1-丙醇、3-甲基丁酸、2-甲基-1-丙醇、乙酸苯乙酯與米香和甜香呈顯著正相關，丁二酸二乙酯、乳酸乙酯、乙酸異戊酯、4-辛酮、十五酸乙酯與酸香、果香、糟香、醇香呈顯著正相關。本研究有望為房縣黃酒的酒體質量控制提供理論支撐。此外，揮發性化合物對香氣的影響與基質、化合物之間的相互作用有很大關系，房縣黃酒中的關鍵香氣化合物及其香氣間的交互作用值得進一步研究；值得注意的是，房縣黃酒中有豐富的萜烯類物質，它們對房縣黃酒的香氣貢獻以及健康功效貢獻可進行下一步研究。