氣相色譜-離子遷移譜結合化學計量學分析成熟時間對牦牛乳干酪揮發性風味物質的影響

劉瑤，喬海軍*，賈志龍*，張衛兵，張春艷，霍尚蕾，苗景源，申夢娜

1(甘肅農業大學 理學院，甘肅 蘭州，730070)2(甘肅農業大學 食品科學與工程學院，甘肅 蘭州，730070) 3(山東海能科學儀器有限公司，山東 濟南，250000)

近年來，隨著生活水平的提高，人們不僅追求高營養價值的乳制品，而且也越來越注重其風味品質[1]。干酪(奶酪)被譽為“奶黃金”，因其富含蛋白質、鈣等營養物質，成為人類攝入乳制品的最佳選擇，而廣受消費者青睞。干酪的風味是消費者嗜好性選擇和決定其品質的重要指標[2]，其風味特征在很大程度上是由揮發性風味物質決定的，它們主要由原料乳中的風味物質及加工過程中乳成分在酶及微生物代謝時產生[3]。牦牛乳干酪(yak milk cheese, YMC)是以新鮮牦牛乳為原料，經添加發酵劑和凝乳酶凝乳制得的新鮮或發酵成熟的乳制品。YMC營養豐富、成熟期較長，且具有獨特的風味特征[4]。因此，系統研究YMC成熟過程中揮發性風味物質組成及差異，確定其特征揮發性風味化合物，對YMC產品的開發和風味品質的控制具有重要意義。

目前，關于YMC風味物質的研究報道相對較少，且不夠系統深入。如牛婕等[5]采用同時蒸餾萃取結合氣相色譜-質譜聯用技術從牦牛乳軟質干酪中共鑒定出46種揮發性風味化合物。王寵等[6]采用固相微萃取結合GC-MS技術從牦牛乳硬質干酪中共鑒定出32種揮發性成分，其中丁酸、異戊醇、甲酸甲酯、乙酸、正己酸和乙酸乙酯為主要揮發性成分。巨玉佳等[7]通過電子鼻技術輔助GC-MS分析認為己酸和2-丁醇是牦牛乳硬質干酪關鍵香氣物質。雖然GC-MS技術已廣泛用于食品揮發性風味物質分析，但存在無法快速檢測、低含量組分定性不準確、需要復雜的預處理等缺點[8]。氣相-離子遷移譜(gas chromatography-ion mobility spectrometry, GC-IMS)技術結合了氣相色譜(GC)高分離能力和離子遷移譜(IMS)快速響應的特點，且具有靈敏度高、響應快、無需預處理、穩定性好、可常壓下工作等優點[9]，目前已被大量用于食品分類及揮發性風味物質指紋圖譜的建立[10]、食品新鮮度和變質評估[11]以及檢測食品儲存過程中揮發性成分的變化[12]等方面。然而，GC-IMS技術用于發酵乳制品揮發性風味成分的檢測鮮見報道，將其用于YMC揮發性風味化合物的分析尚未報道。

本研究以自制YMC為研究對象，采用GC-IMS技術建立不同成熟階段YMC的指紋圖譜，結合偏最小二乘-判別分析(partial least squares-discriminant analysis, PLS-DA)、主成分分析(principal component analysis, PCA)和熱圖分析，解析YMC成熟過程中揮發性組分及差異，并篩選潛在特征揮發性化合物，以期探明不同成熟階段YMC揮發性風味物質的變化規律，為進一步闡明其特征揮發性風味化合物的代謝機理奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮牦牛乳，甘肅省天祝藏族自治縣紅疙瘩牧場(夏季牧場)；發酵劑(保加利亞乳桿菌、嗜熱鏈球菌)，丹尼斯克(中國)有限公司；凝乳酶(小牛皺胃酶和牛胃蛋白酶質量比為7∶3，酶活力890 IMCU/g)，北京多愛特生物科技有限公司；正構酮類C4～C9(2-丁酮、2-戊酮、2-己酮、2-庚酮、2-辛酮和2-壬酮)(分析純)，北京國藥集團化學試劑有限公司；NaCl、無水CaCl2、無水Na2SO4(均為分析純)，天津市北辰方正試劑廠。

1.2 儀器與設備

FlavourSpecc?風味分析儀，德國G.A.S公司；PR224ZH/E析天平，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；XH-C旋渦混合器，金壇區白塔新寶儀器廠。

1.3 實驗方法

1.3.1 樣品制備

參考王寵等[6]的方法并適當修改。新鮮牦牛乳通過63 ℃巴氏殺菌30 min后冷卻至室溫，添加質量濃度為0.006 2 g/L已活化的發酵劑發酵1 h，測其pH值為6.2時，添加質量濃度為0.03 g/L的CaCl2，并加入質量濃度為0.50 g/L的小牛皺胃酶溶液凝乳80 min，經切割、排乳清后，再加入凝塊質量2%的NaCl，并在42 ℃加熱20 min后二次排乳清，堆釀30 min裝入模具壓榨成型，真空包裝后置于人工氣候箱，15 ℃條件下分別成熟1、30、60、90、120、150、180 d。

1.3.2 牦牛乳干酪成熟過程中揮發性風味成分分析

準確稱取3.00 g YMC樣品和3.00 g NaCl，放入研缽研勻后，加入20 mL頂空瓶密封，進行GC-IMS分析，每個樣品平行3次。

頂空進樣條件：孵育溫度80 ℃；孵育時間20 min；進樣針溫度85 ℃；進樣體積200 μL。

GC條件：色譜柱：MXT-5(15 m×0.53 mm×1.0 μm)；柱溫60 ℃；初始流速2 mL/min，保持2 min；10 min內線性升至10 mL/min，不保持；20 min內線性升至100 mL/min，保持10 min。

IMS條件：漂移氣流量150 mL/min；載氣/漂移氣：N2(純度≥99.999%)；載氣流量0～2 min，2 mL/min；IMS溫度45 ℃。

1.4 統計分析

利用儀器配套的分析軟件VOCal、GC×IMS Library Search和內置插件(Reporter、Gallery Plot和Dynamic PCA插件)進行數據采集和分析。應用Library Search軟件內置的NIST和IMS數據庫進行定性分析；利用Reporter和Gallery Plot插件對比指紋圖譜的差異；利用Dynamic PCA插件進行聚類分析。采用SIMCA-P14.1軟件進行PLS-DA建模分析。采用origin 2018進行統計分析及制圖。

2 結果與分析

2.1 不同成熟階段牦牛乳干酪GC-IMS揮發性風味物質差異分析

由Reporter插件生成不同成熟階段YMC揮發性風味物質的GC-IMS三維譜圖，由圖1所示，其中X軸為遷移時間，Y軸為保留時間，Z軸為峰強度[9]。成熟1 d時YMC的揮發性風味物質種類最少；成熟30～90 d時揮發性風味物質種類相似，但信號強度有所不同；成熟120～180 d時揮發性風味物質明顯多于成熟1～90 d時的YMC樣品；不同成熟階段YMC的揮發性風味物質差異較大。

圖2-a是不同成熟階段YMC揮發性風味物質的GC-IMS二維譜圖。不同成熟階段樣品間揮發性風味物質的差異主要體現在離子峰的位置、數量、強度和時間上。背景為藍色，橫坐標1.0處紅色豎線為反應離子峰(reaction ion peak, RIP)。RIP峰兩側的每1個點代表1種揮發性風味化合物，顏色代表物質的信號強度。白色表示低強度，紅色表示高強度，顏色越深，強度越大[9]。為了更加清晰地比較樣品之間的差異，采用差異對比模式，結果見圖2-b。通過從二維俯視圖(以15-CR-1 d為背景)中扣除背景，得到樣品揮發性風味物質的變化差異圖，扣除背景后為白色，紅色表示物質濃度高于參考值，藍色表示物質濃度低于參考值[9]。從圖2-b可以更加直觀看出，大多數紅色信號(圖2-b中紅色框區域)出現在100～600 s的停留時間范圍內，漂移時間為1.0～1.5 ms；成熟120～180 d時，漂移時間迅速增加至1.8 ms；此外，圖2-b紅框中紅色點的數量明顯增加，且紅色點的顏色逐漸加深，這表明隨著成熟時間的延長，揮發性風味物質在逐漸積累，這與程晶晶等[13]的研究結果相似。

2.2 不同成熟階段牦牛乳干酪GC-IMS揮發性風味物質定性分析

采用FlavourSpec?GC-IMS內置的NIST和IMS數據庫，結合保留指數、保留時間和遷移時間，以正構酮類作為外標物計算每種揮發性物質的保留指數，進行化合物定性分析[14]，不同成熟階段YMC的揮發性風味物質定性分析結果見表1(其中部分化合物以單體和二聚體形態存在)。

a-二維俯視圖；b-差異圖譜圖2 不同成熟階段YMC的GC-IMS二維譜圖Fig.2 Two dimensional GC-IMS spectra of YMC at different ripening stages

表1 不同成熟階段牦牛乳干酪中揮發性化合物定性鑒定結果Table 1 Qualitative identification results of volatile compounds of YMC at different ripening stages

由表1可知，從檢測到的46個信號峰中，共鑒定了22種揮發性風味化合物，包括8種酯類、5種酮類、4種醇類、3種醛類、1種吡啶類和1種其他類。其中酯類包括乙酸乙酯二聚體、己酸乙酯二聚體、丙酸乙酯、丁酸乙酯、乳酸乙酯、乙酸異戊酯、2-甲基丁酸乙酯和辛酸乙酯，MOLIMARD等[15]認為酯類物質是由干酪成熟過程中脂肪酸與乳糖發酵產生的醇類酯化反應產生，它們為YMC貢獻了濃郁果香味；酮類包括乙偶姻、2-庚酮二聚體、2-丁酮、2-戊酮二聚體和雙乙酰，它們主要由不飽和脂肪酸氧化產生[16]，為YMC提供了奶油香味和辛辣味；醇類包括乙醇、正丁醇、3-甲基-3-丁烯-1-醇和正己醇，主要來源于乳糖代謝、甲基酮還原、氨基酸代謝和亞油酸、亞麻酸降解等[17]，賦予了YMC辛辣味、酒香、嫩枝氣息和脂香味；醛類包括異戊醛二聚體、正戊醛、苯甲醛，脂肪酸代謝或Strecker降解可能是醛類化合物的主要來源[18]，為YMC提供了蘋果味和杏仁味；而2,4,6,-三甲基吡啶和烯丙基腈為YMC貢獻了芳香味和大蔥味。這些揮發性物質共同構建了YMC獨特的風味。

2.3 不同成熟階段牦牛乳干酪揮發性風味物質指紋圖譜

為解析不同成熟階段YMC揮發性風味化合物的差異性，根據GC-IMS二維圖譜中全部信號峰，構建了不同成熟階段YMC揮發性風味化合物指紋圖譜，如圖3所示，并標識了不同成熟階段的特征峰區域。橫坐標表示所檢測到的揮發性風味化合物，縱坐標表示不同成熟階段，每一行代表1個成熟階段所選全部信號峰的3次平行，每一列代表不同成熟階段檢測到的YMC揮發性風味化合物信號峰(顏色越深，反應該物質的含量較高)。橫坐標中阿拉伯數字表示的化合物未被定性，不作分析。

從指紋圖譜(圖3)可以看出不同成熟階段YMC樣品中揮發性風味物質組成及差異。為了方便觀察比較，將其分為5個區域(圖3)，分別為A、B、C、D、E。圖中A區域為成熟1 d時YMC的揮發性風味物質，在成熟過程中含量逐漸降低，主要有乙偶姻、乙醇、戊醛和2-庚酮二聚體，而戊醛的濃度在成熟60 d時有所提升。圖中B區域物質(3-甲基-3-丁烯-1-醇)代表成熟30 d時YMC的揮發性風味物質，其濃度遠大于其他成熟階段樣品，并為YMC提供了清香味和青草味，這與GARDE等[19]研究結果一致。圖中C區域物質(乳酸乙酯、烯丙基腈和雙乙酰)代表成熟60 d時YMC的揮發性風味物質。圖中D區域物質顯示了成熟120 d時YMC的揮發性風味物質，主要有丙酸乙酯、異戊醛二聚體、己酸乙酯二聚體、2-丁酮、2-甲基丁酸乙酯、辛酸乙酯和2,4,6-三甲基吡啶，且在成熟過程中濃度先升高后降低。圖中E區域物質(丁酸乙酯、乙酸異戊酯、1-丁醇、苯甲醛、1-己醇、2-戊酮二聚體和乙酸乙酯二聚體)代表成熟180 d時YMC的揮發性風味物質，其在整個成熟過程中的峰顏色明顯較深，表明這些物質的含量高于其他成熟階段YMC的樣品，而乙酸乙酯、丁酸乙酯和2-戊酮等，與巨玉佳等[7]報道的牦牛乳硬質干酪中揮發性風味物質的研究結果一致。此外，在成熟過程中，乙偶姻、戊醛、3-甲基-3-丁烯-1-醇、乳酸乙酯、烯丙基腈、雙乙酰、丙酸乙酯、異戊醛和2,4,6-三甲基吡啶，在牛婕等[5]從牦牛乳軟質干酪鑒定出32種揮發性成分中未見報道。

圖3 不同成熟階段YMC中揮發性有機物的指紋圖譜Fig.3 Gallery fingerprint of volatile organic compounds of YMC at different ripening stages

從YMC不同成熟階段揮發性風味物質的相對含量柱狀圖(圖4)可進一步看出，YMC中揮發性成分以酮類(31%～66%)、酯類(8%～45%)和醇類(8%～20%)為主，其次是醛類(3%～9%)和吡啶類(1%～8%)。成熟1 d的YMC中揮發性風味物質主要是酮類、醇類、醛類和酯類。成熟30～60 d時酮類、醛類、醇類含量逐漸降低，當成熟90 d時，酮類化合物含量有所增加，這可能是由于干酪中脂肪酸含量顯著降低，部分脂肪酸在微生物作用下轉變為甲基酮[20]而導致的，這與牛婕等[5]研究結果一致；醛類容易被氧化成酸類或者還原為醇類[17]；醇類與脂肪酸發生酯化反應形成酯類物質[15]，這可能是導致醇類含量降低而酯類含量有所上升的主要原因。此外，隨著成熟時間的延長，酯類逐漸積累，在很大程度上，酯類可以掩蓋因脂肪酸類化合物濃度過高所帶來的不愉快的味道，從而賦予干酪更加柔和的風味[21]。

圖4 YMC成熟過程中揮發性組分相對含量變化Fig.4 The changes of relative contents of volatile components during the ripening of YMC

2.4 不同成熟階段牦牛乳干酪中揮發性風味物質PLS-DA及模型驗證

PLS-DA是一種將數據進行降維，實現復雜數據的可視化及判別分析和預測[22]。利用PLS-DA得分圖對不同成熟時間的YMC揮發性風味物質進行分析，結果如圖5-a所示。隨機改變分類變量的排列順序建立相應的模型，R2X=0.995，R2Y=0.996，當R2和Q2處于0.5～1時，表明模型有較好的概括解釋率，Q2=0.99表示模型有較好的預測能力。當模型的穩定性和預測能力都比較好時，說明構建的模型穩定性及預測能力均達到要求，可用于區分不同成熟時間YMC中揮發性風味物質組成的差異。

利用置換檢驗對PLS-DA所做的模型進行驗證，在PLS-DA中使用7倍交叉驗證預測殘差(CV-ANOVA)方差分析和200次順序上的置換重新得出評價模型的性能指標結果如圖5-b所示。圖中Q2代表累計交叉預測能力，數值與模型預測能力成正比關系；R2代表累計方差值，表示有多少原始數據被用來建立新的PLS-DA判別模型，數值越大則表示模型的解釋能力越強[23]。其中，R2X=0.995，R2Y=0.996，Q2=0.990，R2X-R2Y<0.3，則表明所建模型擬合效果可靠。從圖5-b可以看出，R2與左邊縱軸相交(0，0.247)，Q2與左邊縱軸相交(0，-0.68)，2條回歸線斜率較大，且所有的R2和Q2原始值均高于試驗值，這表明該模型具有較好預測能力，無過擬合現象，可用于不同成熟階段YMC揮發性風味物質的分類判別。

依據PLS-DA模型中的變量重要性(variable important for the projection, VIP)將每個變量對YMC風味的貢獻進一步量化(圖5-c)，篩選VIP>1的揮發性風味化合物作為潛在特征揮發性標志物[24](VIP值越大，差異越顯著)。從圖5-c中可看出共篩選了12種VIP>1的潛在特征揮發性標志物，分別是3-甲基-3-丁烯-1-醇、乙酸乙酯二聚體、乙偶姻、乙酸異戊酯、乙醇、丁酸乙酯、2-丁酮、正丁醇、己酸乙酯二聚體、烯丙基腈、2-戊酮和苯甲醛。

a-得分圖；b-PLS-DA擬合曲線；c-VIP值分布圖5 不同成熟時間YMC中揮發性有機物的得分圖、 PLS-DA擬合曲線及VIP值分布Fig.5 Score plot,PLS-DA simulation and VIP distribution of YMC volatile components at different ripening stages

2.5 不同成熟時間牦牛乳干酪特征揮發性風味物質聚類分析

通過PCA可直觀地判別區分YMC樣品間的差異。從圖6-a不同成熟階段YMC主成分分析結果可以看出，PC1(53.00%)和PC2(17.00%)的累積方差貢獻率為70.00%，這表明PCA分離模型是有效的[25]。與成熟30～180 d的樣品相比，成熟1 d的樣品相距較遠，樣品間組分差異最大，成熟30～90 d的YMC樣品分布在同一象限，距離較近，說明它們之間組分差異較小，成熟120～180 d的YMC樣品彼此接近，都分布在第一象限，這表明樣品間揮發性風味組分差異較小。顯然，每個樣本都可以區分于其他樣本，基于PCA分析結果能較好地區分YMC的不同成熟階段。

a-主成分分析；b-聚類熱圖圖6 不同成熟階段YMC特征揮發性物質 主成分及聚類熱圖分析Fig.6 PCA and clustering heat map of characteristic volatile organic compounds of YMC at different ripening stages

為了直觀區分不同成熟階段YMC特征揮發性化合物的變化，依據篩選出的12種特征揮發性標志物的峰強度值繪制熱圖(圖6-b)。從圖6-b聚類熱圖的凝聚層級聚類分析結果可以看出，YMC的成熟階段分為3個時期，分別為成熟前期(1 d)、成熟中期(30、60、90 d)和成熟后期(120、150、180 d)。YMC特征揮發性風味化合物在不同成熟時期存在明顯差異，在YMC成熟前期，2-戊酮二聚體、苯甲醛、乙偶姻和乙醇含量相對較高，其中乙醇在成熟前期含量最高，且隨著成熟時間的延長而降低；成熟中期YMC樣品揮發性風味物質種類較少，其中烯丙基腈和3-甲基-3-丁烯-1-醇在成熟中期含量最高，成熟后期隨之降低；成熟后期YMC揮發性風味物質的種類較多，其中正丁醇、丁酸乙酯、2-戊酮二聚體、2-丁酮、己酸乙酯二聚體、苯甲醛和乙酸異戊酯含量最高，因此它們是YMC成熟后期的特征揮發性標志物。

3 結論

本研究采用GC-IMS技術對YMC成熟過程中揮發性風味化合物的變化進行了分析，從46個信號峰中共鑒定出22種揮發性風味物質，包括4種醇類、5種酮類、3種醛類、8種酯類、1種吡啶和1種其他。不同成熟時間YMC中揮發性風味物質的含量存在明顯差異，成熟前期(1 d)乙醇含量最高；成熟中期(30、60、90 d)，烯丙基腈和3-甲基-3-丁烯-1-醇含量最高，且隨著成熟時間延長含量呈遞減趨勢；成熟后期(120、150、180 d)正丁醇、丁酸乙酯、2-戊酮二聚體、2-丁酮、己酸乙酯二聚體、苯甲醛和乙酸異戊酯含量最高。PLS-DA和熱圖分析結果共篩選出了12種潛在特征揮發性標志物(VIP>1)，包括3-甲基-3-丁烯-1-醇、乙酸乙酯二聚體、乙偶姻、乙酸異戊酯、乙醇、丁酸乙酯、2-丁酮、正丁醇、己酸乙酯二聚體、烯丙基腈、2-戊酮和苯甲醛。主成分分析結果表明，能較好區分不同成熟時間的YMC樣品。研究結果可為YMC產品的開發和風味品質的控制提供依據，并為進一步闡明其特征揮發性風味化合物的代謝機理奠定基礎。