WNT16B對體外培養宮骶韌帶成纖維細胞增殖和膠原分泌的影響

李蕾，陳娟，史宏暉，朱蘭

(中國醫學科學院 北京協和醫學院 北京協和醫院普通婦科中心，國家婦產疾病臨床醫學研究中心，北京 100730)

盆腔器官脫垂(pelvic organ prolapse，POP)是盆底支持結構缺陷、損傷及退化等因素，導致支持薄弱，使生殖器官與其相鄰臟器發生移位，引起一系列功能紊亂，臨床上表現為子宮脫垂、陰道壁膨出等[1]。隨著人口老年化進程加快，該類疾患已成為嚴重影響中老年婦女健康和生活質量的醫療問題和突出的社會問題，給家庭和社會帶來沉重的負擔。該病的病因和發病機制并不十分清楚。

根據Dellancy的三水平理論[2]，宮骶韌帶是承托盆腔器官的第一水平支持結構，主要由成纖維細胞及其分泌的細胞外基質構成，成纖維細胞是組織塑型的關鍵細胞。WNT通路是調節細胞增殖、細胞極性和細胞命運決定的重要信號通路，WNT家族蛋白共有19種[3]。我們先期研究發現POP患者宮骶韌帶成纖維細胞中分泌型糖蛋白WNT16B表達量減少，且細胞的生長增殖活性下降[4]，推測與盆底支持結構薄弱有關，但是兩者之間是否有關聯目前尚無報道。本實驗通過轉染WNT16B至體外培養的原代成纖維細胞，觀察WNT16B信號通路持續激活對宮骶韌帶成纖維細胞增殖和膠原分泌的影響，探討其在POP發病中的作用機制。

資料與方法

一、研究對象

選擇2018年10月至2021年6月在北京協和醫院婦產科行陰式子宮全切除術的絕經后POP患者4例，取同期因婦科良性疾病行全子宮切除術的絕經后非POP患者2例作為對照。對照患者的年齡、絕經時間和產次與POP患者相匹配。

POP患者和對照患者既往均無慢性盆腔炎癥、子宮內膜異位癥、婦科惡性腫瘤、結締組織疾病等。POP患者由資深臨床醫師按照POP定量分度(POP-Q)法進行診斷，均為子宮脫垂合并陰道前壁膨出Ⅲ～Ⅳ度，不伴有壓力性尿失禁。對照患者為腹腔鏡輔助陰式全子宮切除的婦科良性疾病患者(宮頸癌前病變、無功能卵巢囊腫等)，無POP及尿失禁癥狀。

本研究經本院倫理委員會批準，患者均知情同意。

二、主要試劑與儀器

RNeasy Micro Kit提取試劑盒(Qiagen，德國)；AMV Reverse Transcriptase反轉錄試劑(Promega，美國)；SYBR Premix Ex Taq IIRR820A熒光定量PCR試劑盒(TaKaRa，日本)；PCR引物由上海生工生物工程公司合成；E-Plate 16培養板(艾森生物，美國)；培養基和胎牛血清(Gibco，美國)。

BX51型正立式顯微鏡(Olympus，日本)；7500實時熒光定量PCR儀(ABI，美國)；LEICA SP8激光共聚焦顯微鏡(LEICA，德國)；低速離心機(Thermo，美國)；Maestro Z實時無標記細胞分析儀(RTCA)(AxionBiosystems，美國)。

三、研究方法

1.細胞來源：由資深醫師在婦科子宮全切術中取材，宮骶韌帶取自韌帶與宮頸連接處以外0.5～1.0 cm處。取后的組織標本用1% Ⅰ型膠原酶消化2 h，離心后，用含15%胎牛血清的M199培養基進行原代細胞培養。差時貼壁法對培養出的宮骶韌帶成纖維細胞進行純化，3代至8代的宮骶韌帶成纖維細胞用于實驗研究。

2.細胞培養：將分離自不同患者的宮骶韌帶成纖維細胞用含有10%胎牛血清的高糖DMEM培養基，置于37℃、5%CO2培養箱中培養，細胞融合度達到70%～80%時，以0.25% 胰酶消化細胞傳代培養。

3.宮骶韌帶成纖維細胞中WNT16B和I型膠原蛋白(COLI)mRNA表達水平的檢測：將體外培養的宮骶韌帶成纖維細胞消化后，使用RNA提取試劑盒提取細胞總RNA，使用RT-PCR方法檢測WNT16B和I型膠原蛋白基因的表達水平，3-磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)作為內參基因。用相對定量的方法(2-ΔΔCt)，比較POP各病例與對照各病例之間WNT16BmRNA表達，以及轉染細胞前后WNT16B和COLImRNA的表達水平。每個實驗均重復3次。引物序列見表1。

表1 引物序列

4.實時無標記細胞分析系統(RTCA)檢測細胞增殖：將培養至第3代的宮骶韌帶成纖維細胞以0.25%胰酶消化成單細胞懸液，臺盼藍計數后調整細胞密度為30 000/ml，取100 μl細胞懸液加入預處理過的E-Plate 16培養板，選取細胞對數生長期的生長曲線，計算細胞的倍增時間。實驗重復3次。

5.WNT16B過表達載體構建：人WNT16B編碼區由上海捷瑞生物工程有限公司合成，一個自剪切序列2A被引入到WNT16B基因的N端。將合成的2A-WNT16B序列插入到pEGFP-C1質粒的BamHI位點。之后將CMV-EGFP-2A-WNT16B-polyA表達框插入慢病毒表達載體PLKO-puro的ClaI和EcoRI位點之間，得到慢病毒表達載體pLKO-CMV-EGFP-2A-WNT16B(圖1)。

將人WNT16B編碼區插入到ClaI和EcoRI位點，得到慢病毒表達載體pLKO-CMV-EGFP-2A-WNT16B。

6.病毒包裝以及細胞感染：轉染實驗的前一天，將(1.5～2.5)×106對數期293T細胞種到60 mm培養皿中，使用5 ml含有10%FBS的DMEM培養基培養過夜。將慢病毒表達載體pLKO-CMV-EGFP-2A-WNT16B與包裝質粒delta8.9及水泡性口炎包裝質粒(VSVG)以2∶2∶1的比例混合，以脂質體lipofectamine LTX 轉染進入293T細胞，4～6 h后，將培養基更換為含有30%FBS的DMEM培養基，繼續培養48 h后收集培養基上清，以0.45 μm濾膜過濾后分裝備用。將制備的病毒上清加入培養的宮骶韌帶成纖維細胞上清，同時加入聚凝胺(polybrene)至終濃度為8 μg/ml。48 h后，更換為新鮮培養基，使用中濃度(1 μg/ml)的嘌呤霉素篩選7 d后收集細胞，用RT-PCR方法檢測WNT16B和COLImRNA表達水平(詳見前述)。

四、統計方法

采用SPSS17.0軟件包進行統計學分析。患者兩兩間比較采用t檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

一、樣本信息

收集POP患者4例(編號121029、121127、130115以及121123am)，非POP對照患者2例(編號130129、121207)。患者間年齡、絕經時間和產次相匹配(表2)。

表2 患者收樣信息

二、POP患者與非POP對照患者宮骶韌帶成纖維細胞WNT16B基因的表達

消化培養宮骶韌帶組織成纖維細胞，提取細胞的總RNA，使用RT-PCR檢測非POP對照患者2例(編號130129和121207)以及POP患者4例(編號121029、121127、130115以及121123am)的宮骶韌帶成纖維細胞中WNT16B的mRNA的表達水平。與對照病例比較，所檢測的4例POP病例中3例的宮骶韌帶成纖維細胞WNT16BmRNA水平均顯著低于2例對照病例(P<0.001)(圖2)。

與對照病例121207比較，*P<0.001；與對照病例130129比較，#P<0.001。

三、WNT16B慢病毒轉染原代成纖維細胞

由于POP患者宮骶韌帶成纖維細胞WNT16B表達水平低于非POP對照患者，以WNT16B慢病毒轉染POP患者宮骶韌帶成纖維細胞后，提取總RNA，以RT-PCR法檢測轉染前后細胞中WNT16BmRNA的水平。結果顯示病毒轉染后的成纖維細胞，WNT16BmRNA水平均比轉染前有顯著提高(P<0.001)(圖3)。

與各自轉染前比較，*P<0.001。

四、WNT16B慢病毒轉染原代成纖維細胞后細胞的增殖情況

以WNT16B慢病毒轉染POP患者宮骶韌帶成纖維細胞后，以實時無標記細胞分析系統(RTCA)檢測細胞的倍增時間。結果發現，POP患者宮骶韌帶成纖維細胞在WNT16B慢病毒轉染后倍增時間均比未轉染細胞顯著縮短(P<0.05)(圖4)，說明WNT16B能夠顯著提高POP患者成纖維細胞的增殖活性。

與各自轉染前比較，*P<0.05，#P<0.001。

五、WNT16B慢病毒轉染原代宮骶韌帶成纖維細胞后膠原I的表達

以WNT16B慢病毒感染POP患者宮骶韌帶成纖維細胞后，提取總RNA，以RT-PCR法檢測感染前后細胞中膠原I(COLⅠ)mRNA的表達水平。結果顯示慢病毒感染后的成纖維細胞COLImRNA水平均比轉染前有顯著提高(P<0.05)(圖5)。

與各自轉染前比較，*P<0.05，#P<0.01。

討 論

在盆底的支撐系統中，盆腔器官周圍的纖維結締組織形成筋膜和韌帶，對抗腹壓和重力，維持陰道及其鄰近器官的解剖位置。有關POP的發病機制中，盆底支持結構中細胞外基質的組成和功能異常被人們所熟知，但是有關成纖維細胞的形態及功能研究還非常有限[5]。

成纖維細胞是結締組織中主要細胞，能分泌細胞外基質及相關代謝酶(如金屬基質蛋白酶和金屬蛋白酶組織抑制劑)，參與膠原纖維合成、成熟和降解過程。盆底支持結構中的成纖維細胞能感受機械力和局部生物化學刺激，維持細胞外基質合成代謝和分解代謝的動態平衡，在組織塑型中起關鍵作用[6]。因此成纖維細胞的功能狀態是影響盆底功能的重要環節。研究發現，與非POP患者盆底組織相比，POP患者盆底支持韌帶中成纖維細胞的增殖能力降低、細胞存活率低，POP患者盆底組織宮骶韌帶胞外基質的Ⅰ型、Ⅲ型膠原以及彈性蛋白水平下降，對異常牽拉產生的應力反應性降低[7-9]。

WNT為分泌型糖蛋白，WNT信號通路可以在不同發育階段調節細胞基本功能，如增殖、分化、遷移和細胞極性等。目前已鑒定出至少19個人類WNT基因，WNT16是WNT家族的新成員，有WNT16A和WNT16B兩種異構體，WNT16B能在人體多種組織中表達[10-11]，且在體外能夠通過載體進行穩定轉染和表達[12]。我們先期的研究通過基因組表達芯片，在國內外首次發現POP患者的WNT16相關信號通路的基因表達與年齡、絕經狀態相匹配的正常對照相比有明顯異常[13]。Xie等[14]通過RNA-seq的方法也篩選到POP患者有異常的WNT16表達，并與POP分度有關。目前已有的研究表明，WNT16B與細胞的增殖、衰老和腫瘤進展相關，可能是通過經典或非經典的β-連環蛋白信號通路調節[11，15]。另外，WNT16B信號通路還參與組織修復和組織纖維化異常性疾病，比如成人關節軟骨機械性損傷后，WNT16信號通路的激活使關節滑膜細胞過度分泌膠原纖維，與骨關節炎的發生密切相關[16]。但是在WNT16B信號通路對盆底支持結構中成纖維細胞的增殖和膠原分泌功能有無影響，目前尚無報道。

本研究中，POP病例原代培養的宮骶韌帶成纖維細胞與非POP對照病例相比，WNT16B的表達水平顯著下降，這與我們以往已經發表的結果[4]一致。本研究的主要工作是成功構建了WNT16B過表達慢病毒載體，在POP病例過表達目的蛋白，以挽救POP患者宮骶韌帶成纖維細胞WNT16B的低表達水平。在WNT16B的持續激活狀態下，成纖維細胞的倍增時間縮短，分泌膠原I功能增加，能潛在增強組織的支撐功能，提示WNT16B可能是調節成纖維細胞功能、治療POP的一個潛在靶點，值得我們擴大樣本量進一步探索。