新型齊墩果酸-1,2,3-三氮唑衍生物的設計、合成及活性研究*

楊東鑫，王友德，張麗穎

(河北省中藥研究與開發重點實驗室，承德醫學院中藥研究所，河北 承德 067000)

齊墩果酸(oleanolic acid, OA, 圖1)，又名慶四素或土當歸酸，屬齊墩果烷型五環三萜結構的化合物。女貞子為木樨科常綠喬木女貞(ligustrum lucidum ait)的干燥成熟果實。OA為女貞子植物中分離得到的有效成份，以游離體或糖苷的形式廣泛存在于在自然界中。隨著研究不斷進展，OA多樣的藥理作用已被揭曉，如抗腫瘤[1-3]、抗高血糖[4-5]、抗炎[6-7]、抗HIV[8]和抗氧化[9-10]等。OA的降糖作用也受到了廣泛關注：Ortiz-Andrade等通過口服葡萄糖耐量實驗發現，OA可以抑制血漿葡萄糖濃度的增高[11]。然而，OA衍生物相關的降糖作用還未得到系統性研究。

圖1 OA衍生物的合成路線Fig.1 Synthetic route of OA derivatives

三唑類化合物因其具有顯著的廣譜生物活性，已成為研究的熱點藥效團[12-13]。其中，1,2,3-三氮唑結構因其在結合親和力方面表現十分顯著，且具有優良的代謝穩定性，在藥物開發中被廣泛應用[14]。因此，本文推測OA-1,2,3-三氮唑衍生物可能同樣具備降糖作用。實驗中以OA為先導化合物，應用click化學技術[15]和活性基團拼接原理，在OA的C-3位引入含不同取代基的1,2,3-三氮唑結構。本實驗對OA的C-3位進行結構改造，合成了兩種新型OA-1,2,3-三氮唑衍生物，并對其進行了HepG2細胞葡萄糖消耗實驗，以期為女貞子降血糖方面的研究奠定基礎。

1 儀器與試劑

RY-1熔點儀,天津市分析儀器廠；電熱鼓風干燥箱,上海福瑪實驗設備有限公司；AVANCE-300 MHz型核磁共振儀,德國 布魯克公司；數顯示水浴鍋,國華電器有限公司；752分光光度計；maXis impact-HRMS,德國 布魯克公司；SHIMADZU FTIR-8400S傅里葉變換紅外光譜儀,德國布魯克公司。

葡萄糖測定試劑盒,上海榮升生物技術有限公司；FBS胎牛血清,鼎國生物技術有限公司；碳酸氫鈉,南京化學試劑有限公司；RMPI Medium 1640 GIBCO invitrogen corporation；二甲亞砜,上海凌峰化學試劑有限公司。所用試劑均為化學純或分析純試劑。人肝癌細胞HepG2，由承德醫學院附屬醫院檢驗科贈予。

2 方法與結果

2.1 化合物的合成與表征

2.1.1 4-(2-丙炔氧基)苯甲醛(3)

將溴丙炔(0.42 g，3.48 mmol)滴加在對羥基苯甲醛(0.4 g，3.27 mmol)和碳酸鉀(0.87 g，6.32 mmol)的無水DMF(10 mL)混合溶液中，于25 ℃下攪拌12 h。將濾除K2CO3的濾液倒入水中，乙酸乙酯萃取三次，有機相以1 N HCl(aq)、飽和NaHCO3溶液和NaCl水溶液依次洗滌，干燥后減壓蒸餾，得4-(2-丙炔氧基)苯甲醛。無須純化直接用于下一步反應。

2.1.2 3β-[4-醛基苯氧基甲基-(1-氫-1,2,3-三氮唑-1-基)]乙酰氧基齊墩果烷-12-烯-28-羧酸芐酯(7)

將3β-疊氮乙酰氧基齊墩果烷-12-烯-28-羧酸芐酯(6)[16](0.2 g, 0.32 mmol)和4-(2-丙炔氧基)苯甲醛(56 mg, 0.32 mmol) 溶于CH2Cl2/H2O(1/1, 6 mL)的混合溶劑中，攪拌下依次加入CuSO4·5H2O(28 mg, 0.11 mmol)和抗壞血酸鈉(45 mg, 0.23 mmol)。25 ℃下反應12 h后，減壓蒸餾，粗品以乙酸乙酯稀釋，水洗后無水Na2SO4干燥，減壓蒸餾，快速柱層析(乙酸乙酯/石油醚=1/5, V/V)純化，得白色固體產物(0.24 g, 94%)。m.p.90～92 ℃;IR(KBr, cm-1): 2947, 1744, 1727, 1694;1H-NMR(300 MHz): 0.60, 0.72, 0.82, 0.88, 0.89, 0.92, 1.11(each 3H, s), 2.90(1H, dd,J=4.6, 14.5 Hz), 4.55～4.60(1H, m), 5.03(1H, d,J=12.5 Hz), 5.09(1H, d,J=12.5 Hz), 5.17(2H, s), 5.27(1H, t), 5.33(2H, s), 7.11(2H, d,J=6.8 Hz), 7.29～7.36(5H, m), 7.78(1H, s), 7.84(2H, d,J=6.8 Hz), 9.89(2H, s);13C-NMR(75 MHz): 190.6, 177.3, 165.7, 163.1, 143.7, 136.4, 131.9, 128.4, 128.0, 127.9, 124.2, 122.2, 115.1, 84.0, 65.9, 62.1, 55.2, 51.2, 47.5, 46.7, 45.8, 41.7, 41.4, 39.3, 38.0, 37.7, 36.8, 33.8, 33.0, 32.6, 32.3, 30.6, 28.0, 27.6, 25.8, 23.6, 23.4, 23.3, 23.0, 18.1, 16.8, 16.5, 15.3;ESI-MS: 812.4[M+H]+。

2.1.3 3β-[4-甲基苯氧基甲基-(1-氫-1,2,3-三氮唑-1-基)]乙酰氧基齊墩果烷-12-烯-28-羧酸(8)

將上述所得化合物7(81 mg, 0.10 mmol) 溶于四氫呋喃(10 mL)，加入催化量的10%Pd-C。25 ℃下常壓氫化24 h。濾除Pd-C后，減壓蒸餾得粘稠液體。快速柱層析(乙酸乙酯/石油醚=1/4, V/V)純化，得白色固體(36 mg, 51%)。m.p.163～165 ℃;IR(KBr, cm-1): 3349, 2944, 1745, 1692, 1509;1H-NMR(300 MHz): 0.73, 0.74, 0.83, 0.90, 0.91, 0.92, 1.12(each 3H, s), 2.81(1H, d,J=9.8 Hz), 4.55～4.60(1H, m), 5.14(2H, s), 5.22(2H, s), 5.27(1H, t), 6.87(2H, d,J=8.6 Hz), 7.07(2H, d,J=8.6 Hz), 7.73(1H, s);13C-NMR(75 MHz): 183.1, 165.8, 156.1, 142.6, 130.5, 129.9, 123.9, 122.4, 114.6, 83.8, 62.1, 55.2, 51.2, 47.5, 46.5, 45.8, 41.6, 41.0, 39.3, 37.9, 37.7, 36.9, 33.8, 33.0, 32.5, 32.4, 30.6, 28.0, 27.6, 25.8, 23.5, 23.3, 22.9, 20.4, 18.1, 17.0, 16.4, 15.3;ESI-MS: 684.4[M-H]-。

2.2 HepG2細胞葡萄糖消耗作用檢測

2.2.1 實驗方法

參照文獻方法[17], 以胰島素為陽性對照，對目標化合物7和8進行HepG2細胞葡萄糖消耗作用測定實驗。將HepG2細胞以1×105/孔接種于96孔板，用含10%胎牛血清的1640高糖培養液培養，待細胞生長至60%融合時，棄培養液。將細胞分為對照組(空白組與胰島素組)和待測化合物組(化合物7組與化合物8組)，其中胰島素濃度為1×10-7mmol/L，待測化合物組濃度為100 μmol/L。同一水平6孔并列，于培養24 h后采用葡萄糖氧化酶法測定培養液中葡萄糖吸光度以及濃度的變化。通過雙尾學生t-分布檢驗，分別計算空白組與胰島素組、空白組與化合物7組、空白組與化合物8組的葡萄糖吸光度差異，P值<0.05被認為具有統計顯著性。

2.2.2 實驗結果

兩種OA衍生物對HepG2細胞葡萄糖消耗作用的影響結果如表1所示，數據表明，胰島素組表現符合預期，與空白組相比，胰島素組能夠顯著促進HepG2細胞對葡萄糖的消耗(P=0.036)，證明本實驗的可靠性。在高糖環境下，化合物7組和化合物8組在體外預作用24 h后，與空白組相比, 對HepG2細胞的葡萄糖消耗量均起到了促進作用，并增加了細胞對葡萄糖的攝取。值得一提的是，化合物7組能夠顯著促進HepG2細胞對葡萄糖的消耗(P=0.038)，值得進一步研究。

表1 目標化合物對HepG2細胞葡萄糖消耗的影響Table 1 Effects of target compounds on glucose consumption of HepG2 cells

a葡萄糖吸光度=平均值±標準差；b以胰島素為陽性對照；cn=6。

3 結 論

祖國醫學對女貞子的應用已有上千年的歷史，經現代科學研究證實，OA是其主要的活性成分，在體內外實驗中均表現出較好的降血糖活性[18-19]。隨著當今社會人均生活水平的不斷提高，糖尿病已然成為了嚴峻的全球公共衛生問題。據預測，到2045年，全球受到糖尿病的威脅的人數將會增加到6.93億人[20]。因此，開發新型有效抗高血糖藥物以滿足不同的臨床用藥需求顯得尤為重要。

本文以OA為先導化合物，通過click化學技術在OA的C-3位引入1,2,3-三氮唑結構，設計并合成得到兩種未見文獻報道的新型OA-1,2,3-三氮唑衍生物并對其結構進行了確證。此外，本文對上述衍生物進行了HepG2細胞葡萄糖消耗測試。結果表明：OA-1,2,3-三氮唑衍生物具有潛在的降糖作用，為OA-1,2,3-三氮唑衍生物在降糖藥物的研究方面提供了參考數據。