藥用昆蟲凹紋胡蜂三氯甲烷部位化學成分研究

黃艷敏，龐秀琴，許靜蕾，唐宋元，李勇鍵，楊志斌，肖 懷*

（1.云南省昆蟲生物醫藥研發重點實驗室，云南大理 671000；2.藥用特種昆蟲開發國家地方聯合工程研究中心，云南大理 671000；3.中國西南藥用昆蟲及蛛形類資源開發利用2011協同創新中心，云南大理 671000；4.大理大學藥學院，云南大理 671000）

《神農本草經》最早記載了胡蜂類藥材，將其列為上品，主治嗌痛、干嘔、心腹脹滿痛，久服輕身益氣〔1〕。胡蜂亦作為傳統民族驗方，用于預防和治療多種炎癥引起的疾病。如景頗族驗方胡蜂酒已被《中華人民共和國藥典》所收錄〔2〕；彝族醫生習用胡蜂成蟲、蜂巢、分泌物入藥，用于祛風除濕、消腫止痛、攻毒殺蟲〔3〕。胡蜂是一種益多害少的資源昆蟲，其成蟲、幼蟲、蜂巢及蜂毒可藥用、食用，還可用于生物防治〔4〕。近年來，越來越多的研究人員關注胡蜂的資源價值，對其蜂毒活性、營養成分、蛋白質含量、重金屬、常微量元素、揮發性及脂溶性成分等進行了研究〔5-10〕。胡蜂基源眾多，全國約200種，其中云南省分布154種〔11〕。開展系統深入的研究有利于胡蜂資源的可持續開發應用。凹紋胡蜂Vespa aurariaSmith的干燥成蟲可入藥，其性味甘、平、有毒，具有消腫解毒等功效，主要用于治療風濕痹痛、癰腫瘡毒、蜘蛛和蜈蚣咬傷等病癥〔3〕。目前，關于凹紋胡蜂化學成分的研究還很少。本研究從凹紋胡蜂的三氯甲烷提取部位中分離鑒定出11個化合物，分別為：環（丙氨酸-脯氨酸）（1）、環（脯氨酸-脯氨酸）（2）、環（脯氨酸-甘氨酸）（3）、環（脯氨酸-酪氨酸）（4）、環（蘇氨酸-脯氨酸）（5）、N-乙酰基異亮氨酸（6）、N-乙酰基-4-（4-羥基苯）乙胺（7）、煙酸（8）、1-甲基-1，2，3，4-四氫咔啉-3-羧酸（9）、3-吲哚乙酸（10）、（2R，3S）-2-（3'4'-dihydroxyphenyl）-3-acetylamino-7-（N-acetyl-2"-aminoethyl）-1，4-benzodioxane（11）。見圖1。

圖1 化合物1~11的化學結構

1 儀器與材料

Bruker AVⅢ-400型核磁共振波譜儀（德國Bruker公司）；Waters 2535制備型高效液相色譜儀（美國Waters公司）；Agilent 1260分析型高效液相色譜儀（美國Agilent公司）；旋轉蒸發儀（德國Heidolph公司）；EYELA循環冷凝泵（日本東京理化器械株式會社）；Sephadex LH-20葡聚糖凝膠（美國GE Healthcare公司）；柱層析硅膠、薄層層析硅膠（青島海洋化工有限公司）；氘代試劑（上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；色譜用洗脫溶劑分別為經過重蒸的工業純溶劑或化學純溶劑；展開劑所用溶劑均為分析純，均購自天津風船化學試劑科技有限公司。

實驗用凹紋胡蜂由云南省德宏傣族景頗族自治州芒市軒崗鄉胡蜂養殖基地提供，大理大學昆蟲生物醫藥研究院楊自忠教授鑒定為凹紋胡蜂Vespa aurariaSmith，標本保存于云南省昆蟲生物醫藥研發重點實驗室。

2 提取與分離

將32 kg凹紋胡蜂干燥成蟲碾碎，用95%乙醇冷浸提取4次，混合提取液，減壓濃縮至無醇味，加適量蒸餾水混懸后，用石油醚、三氯甲烷、乙酸乙酯和正丁醇依次萃取。將三氯甲烷萃取液減壓濃縮至干得到40 g浸膏，后將其進行硅膠（200~300目）柱層析，用石油醚-三氯甲烷（1∶0→0∶1）和三氯甲烷-甲醇（1∶0→5∶1）梯度洗脫，薄層色譜法檢識，合并為8段（Fr.1~Fr.8）。Fr.3（14.3 g）經反復硅膠（200~300目）柱層析，以石油醚-丙酮溶劑系統梯度洗脫，得到9個組分Fr.3-1~Fr.3-9。Fr.3-9（0.8 g）通過半制備反相高效液相色譜（甲醇-水，5∶95→95∶5）梯度洗脫和Sephadex LH-20凝膠柱色譜（氯仿-甲醇，1∶1），得到化合物1（79.0 mg）、化合物2（30.5 mg）。Fr.4（6.4 g）經反復硅膠（200~300目）柱層析，以三氯甲烷-乙酸乙酯（1∶1）為洗脫劑進行等度洗脫，得到10個流分Fr.4-1~Fr.4-10。Fr.4-7（108.2 mg）采用半制備反相高效液相色譜，甲醇-水（5∶95→95∶5）梯度洗脫得到化合物7（13.4 mg）。Fr.4-8（114.2 mg）反復經硅膠柱色譜（300~400目）、半制備高效液相色譜（甲醇-水，5∶95→95∶5）和Sephadex LH-20凝膠柱色譜（甲醇）得到化合物6（6.2 mg）和化合物10（4.3 mg）。Fr.4-10（116.3 mg）經半制備反相高效液相色譜（甲醇-水，5∶95→95∶5），得到Fr.4-10-1~Fr.4-10-5。Fr.4-10-1（24.3 mg）經Sephadex LH-20凝膠柱色譜（甲醇）反復等度洗脫得到化合物4（5.0 mg）、化合物5（4.5 mg）、化合物8（9.3 mg）。Fr.4-10-2（20.6 mg）經Sephadex LH-20凝膠柱色譜（甲醇）等度洗脫得到化合物3（13.0 mg）。Fr.5（4.5g）經硅膠（200~300目）柱層析，以乙酸乙酯-甲醇（25∶1→0∶1）為溶劑系統梯度洗脫，得到20個組分，Fr.5-1～Fr.5-20。Fr.5-5（116.3 mg）經Sephadex LH-20凝膠柱色譜（三氯甲烷-甲醇，1∶1）等度洗脫得到化合物11（22.1 mg）。Fr.6（1.85 g）采用半制備高效液相色譜（甲醇-水，5∶95→95∶5）梯度洗脫，得到化合物9（7.0 mg）。

3 結構鑒定

化合物1：白色粉末（氯仿），分子式為C8H12N2O2。1H-NMR（400 MHz，CDCl3）δ：4.18-3.98（2H，m，Ala-H-2，Pro-H-2），3.64-3.42（2H，m，Pro-H-5），2.41-2.22（1H，m，Pro-H-3a），2.10-1.93（2H，m，Pro-H-4），1.91-1.81（1H，m，Pro-H-3b），1.42（3H，d，J=5.7 Hz，Ala-H-3）；13C-NMR（100 MHz，CDCl3）δ：170.9（Pro-C-1），166.6（Ala-C-1），59.3（Pro-C-2），51.2（Ala-C-2），45.5（Pro-C-5），28.2（Pro-C-3），22.8（Pro-C-4），15.8（Ala-C-3）。以上波譜數據與文獻〔12〕報道基本一致，化合物1鑒定為環（丙氨酸-脯氨酸）。

化合物2：黃色粉末（甲醇），分子式為C10H14N2O2。1H-NMR（400 MHz，CD3OD）δ：4.35（1H×2，t，J=7.8 Hz，Pro-H-2，H-2'），3.62-3.41（2H×2，m，Pro-H-5，5'），2.39-2.21（2H×2，m，Pro-H-3，3'），2.14–1.86（2H×2，m，Pro-H-4，H-4'）；13C-NMR（100 MHz，CD3OD）δ：168.6（Pro-C-1，C-1'），61.8（Pro-C-2，C-2'），46.3（Pro-C-5，C-5'），28.8（Pro-C-3，C-3'），24.3（Pro-C-4，C-4'）。以上波譜數據與文獻〔13〕報道基本一致，鑒定化合物2為環（脯氨酸-脯氨酸）。

化合物3：白色粉末（甲醇），分子式為C7H10N2O2。1H-NMR（400 MHz，CD3OD）δ：4.23（1H，m，Pro-H-2），4.10（1H，brd，J=16.8，Gly-H-2a），3.73（1H，d，J=16.8 Hz，Gly-H-2b），3.53（2H，m，Pro-H-5），2.39-2.25（2H，m，Pro-H-3），1.95（2H，m，Pro-H-4）；13C-NMR（100 MHz，CD3OD）δ：172.1（Pro-CO），166.5（Gly-CO），59.9（Pro-C-2），47.1（Pro-C-5），46.4（Gly-C-2），29.5（Pro-C-3），23.4（Pro-C-4）。以上波譜數據與文獻〔14〕報道基本一致，化合物3鑒定為環（脯氨酸-甘氨酸）。

化合物4：白色粉末（氯仿），分子式為C14H16N2O3。1H-NMR（400 MHz，CD3OD）δ：7.05（2H，d，J=8.4 Hz，Try-H-2'，6'），6.78（2H，d，J=8.4 Hz，Try-H-3'，5'），4.23（1H，dd，J=9.7，2.8 Hz，Try-H-2），4.09（1H，J=7.5 Hz，Pro-H-2），3.60（2H，m，Pro-H-5），3.46（1H，dd，J=14.5，3.9 Hz，Tyr-H-3a），2.78（1H，dd，J=14.5，9.9 Hz，Tyr-H-3b），2.33（1H，m，Pro-H-3a），2.01（1H，m，Pro-H-3b），1.92（2H，m，Pro-H-4）；13C-NMR（100 MHz，CD3OD）δ：169.9（s，Pro-CO），165.4（Tyr-CO），155.8（Tyr-C-4'），130.5（Tyr-C-2'，6'），127.0（Tyr-C-1'），116.2（Tyr-C-3'，5'），59.3（Pro-C-2），56.4（Tyr-C-2），45.6（Pro-C-5），36.1（Tyr-C-3），28.5（Pro-C-3），22.6（Pro-C-4）。以上波譜數據與文獻〔15〕報道基本一致，化合物4鑒定為環（脯氨酸-酪氨酸）。

化合物5：黃色油狀液體（氯仿），分子式為C9H14N2O3。1H-NMR（400 MHz，CDCl3）δ：4.36（1H，dt，J=7.0，3.5 Hz，Thr-H-2），4.10（1H，m，Pro-H-2），3.71（1H，brs，Thr-OH），3.53（2H，m，Pro-H-5），2.35（1H，m，Pro-H-3a），2.10（1H，m，Pro-H-3b），2.03（1H，m，Pro-H-4a），1.91（1H，m，Pro-H-4b），1.34（3H，d，J=6.6 Hz，Thr-H-4）；13C-NMR（100 MHz，CDCl3）δ：170.3（Thr-C-1），165.5（Pro-C-1），65.7（Thr-C-3），59.5（Pro-C-2），59.1（Thr-C-2），45.4（Pro-C-5），28.2（Pro-C-3），22.8（Pro-C-4），19.1（Thr-C-4）。以上波譜數據與文獻〔16〕報道基本一致，化合物5鑒定為環（蘇氨酸-脯氨酸）。

化合物6：白色粉末（甲醇），分子式為C8H15NO3。1H-NMR（400 MHz，D2O）δ：4.05（1H，d，J=5.8 Hz，H-2），1.86（3H，s，H-2′），1.79-1.67（1H，m，H-3），1.27（2H，ddd，J=12.1，7.3，4.5Hz，H-4），1.05（3H，dt，J=13.8，7.5 Hz，H-6），0.79-0.67（3H，m，H-5）；13C-NMR（100 MHz，D2O）δ：176.1（C-1），174.1（C-1'），58.0（C-2），36.1（C-3），24.5（C-4），21.4（C-2'），14.8（C-6），10.6（C-5）。以上波譜數據與文獻〔17〕報道基本一致，化合物6鑒定為N-乙酰基異亮氨酸。

化合物7：白色固體（甲醇），分子式為C10H13NO2。1H-NMR（400 MHz，CD3OD）δ：7.02（2H，d，J=8.5 Hz，H-2，6），6.70（2H，d，J=8.5 Hz，H-3，5），3.35（2H，t，J=2.5 Hz，H-8），2.68（2H，t，J=7.4Hz，H-7），1.90（3H，s，H-2'）；13C-NMR（100 MHz，CD3OD）δ：173.4（C-1'），157.1（C-4），131.4（C-1），130.9（C-2，6），116.4（C-3，5），42.6（C-8），35.8（C-7），22.7（C-2'）。以上波譜數據與文獻〔18〕報道基本一致，化合物7鑒定為N-乙酰基-4-（4-羥基苯）乙胺。

化合物8：白色粉末（氯仿），分子式為C6H5NO2。1H-NMR（400 MHz，CDCl3）δ：9.05（1H，s，H-2），8.77（1H，s，H-6），8.21（1H，s，H-4），7.44（1H，dd，J=7.9，4.9 Hz，H-5）；13C-NMR（100 MHz，CDCl3）δ：169.6（C-7），152.7（C-6），148.3（C-2），135.9（C-4），129.3（C-3），123.9（C-5）。以上波譜數據與文獻〔19〕報道基本一致，化合物8鑒定為煙酸。

化合物9：淡黃色粉末（甲醇），分子式為C13H14N2O2。1H-NMR（400 MHz，CD3OD）δ：7.42（1H，d，J=7.8 Hz，H-5），7.28（1H，d，J=8.1 Hz，H-8），7.07（1H，t，J=7.6 Hz，H-7），6.98（1H，t，J=7.5 Hz，H-6），4.13（1H，d，J=6.6 Hz，H-1），3.92（1H，dd，J=12.1，5.0 Hz，H-3），3.43-3.31（1H，m，H-4a），3.02-2.90（1H，m，H-4b），1.68（3H，d，J=6.7 Hz，H-10）；13C-NMR（100 MHz，CD3OD）δ：138.8（C-8a），131.8（C-9a），127.5（C-4b），123.4（C-7），120.7（C-6），119.3（C-5），112.4（C-8），107.9（C-4a），59.7（C-3），51.2（C-1），24.4（C-4），17.2（C-10）。以上波譜數據與文獻〔20〕報道基本一致，化合物9鑒定為1-甲基-1，2，3，4-四氫咔啉-3-羧酸。

化合物10：白色粉末（甲醇），分子式為C10H9NO2。1H-NMR（400 MHz，D2O）δ：7.42（1H，d，J=7.9 Hz，H-8），7.32（1H，d，J=8.1 Hz，H-7），7.18（1H，d，J=6.2 Hz，H-2），7.14-7.03（1H，m，H-5），6.98（1H，t，J=7.4 Hz，H-6），3.56（2H，s，H-10）；13C-NMR（100 MHz，D2O）δ：178.3（-COOH），136.0（C-8），128.5（C-9），124.8（C-2），121.9（C-5），119.3（C-6），118.1（C-4），111.7（C-7），107.4（C-3），39.5（C-10）。以上波譜數據與文獻〔21〕報道基本一致，化合物10鑒定為3-吲哚乙酸。

化合物11：淡黃色粉末（甲醇），分子式為C20H22N2O6。1H-NMR（400 MHz，CD3OD）δ：6.85（1H，d，J=1.7 Hz，H-2'），6.82（1H，s，H-6），6.80（1H，d，J=2.0 Hz，H-5'），6.75（1H，s，H-8），6.74（1H，d，J=1.8Hz，H-5），6.72（1H，d，J=1.9 Hz，H-6'），5.68（1H，d，J=7.0，5.2 Hz，H-3），4.68（1H，d，J=7.0 Hz，H-2），3.29（2H，t，J=7.2 Hz，H-2''），2.64（2H，t，J=7.3 Hz，H-1''），1.91（3H，s，CH3），1.87（3H，s，CH3）；13C-NMR（100 MHz，CD3OD）δ：173.3（CO），173.2（CO），147.1（C-4'），146.4（C-3'），144.2（C-8a），142.1（C-4a），134.1（C-7），128.7（C-1'），123.2（C-6），120.5（C-6'），118.0（C-8），117.9（C-5），116.0（C-5'），115.5（C-2'），78.3（C-2），78.2（C-3），42.1（C-2''），35.7（C-1''），22.6（CH3），22.5（CH3）。以上波譜數據與文獻〔22〕報道基本一致，化合物11鑒定為（2R，3S）-2-（3'，4'-dihydroxyphenyl）-3-acetylamino-7-（N-acetyl-2''-aminoethyl）-1，4-benzodioxane。

4 討論

本研究對凹紋胡蜂的化學成分進行研究，從三氯甲烷部位分離鑒定出11個化合物，均為首次從該藥用昆蟲中分離得到，其中包括5個環二肽類化合物（1~5）。環二肽是由兩個氨基酸通過脫水縮合形成肽鍵環合而成，是一種重要的生物活性分子，其骨架是比較穩定的六元含氮雜環，含兩個氫鍵受體、兩個氫鍵供體〔23〕。許多環二肽具有抗菌、抗癌、鎮痛、抗感染、抑制毒素生成等生物活性〔24〕。化合物11屬于多巴胺類二聚體，在該昆蟲提取物較大極性的乙酸乙酯萃取部位也分離到了多個類似成分。此類化合物普遍存在于昆蟲體內，種類較多，部分化合物含量也比較高，其生物活性、種間差異等有待進行深入研究探討。