水溶性蜂膠對酒精加重潰瘍性結(jié)腸炎發(fā)作的影響和機(jī)制研究

張 平，方 瓊，周 華

（安徽醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校，合肥 230601）

潰瘍性結(jié)腸炎（ulcerative colitis，UC）是炎癥性腸病（inflammatory bowel diseases，IBD）的主要形式，它是一種終身性疾病，其特征是持續(xù)的/彌漫性的炎癥，可從直腸近端擴(kuò)散，并定位于結(jié)腸黏膜，主要的臨床表現(xiàn)為腹部疼痛、便血、體質(zhì)量減輕、結(jié)腸縮短及貧血等〔1〕，特征是無癥狀緩解和活動性疾病發(fā)作的不斷循環(huán)〔2〕。它的發(fā)病機(jī)理涉及遺傳和環(huán)境因素之間復(fù)雜的相互作用，是由各種遺傳傾向的患者對腸道內(nèi)容物不受控制的免疫反應(yīng)誘導(dǎo)，是一種免疫炎癥性疾病，已日漸成為導(dǎo)致生活質(zhì)量惡化和公共醫(yī)療系統(tǒng)負(fù)擔(dān)增加的公共衛(wèi)生問題。

流行病學(xué)模式的變化提出飲食因素是UC加重的潛在觸發(fā)因素，臨床數(shù)據(jù)證實，UC患者中飲酒者復(fù)發(fā)的風(fēng)險更高，且UC患者在飲酒后出現(xiàn)的胃腸道癥狀比腸易激綜合征患者更嚴(yán)重。但“酒文化”是社交場合不可避免的，很多UC患者飲酒很常見。對酒精如何加重UC發(fā)作尚未得到深入研究。

文獻(xiàn)〔3〕報道，飲食中富含多酚、黃酮的水果和蔬菜的攝入量與UC低風(fēng)險相關(guān)。蜂膠是大自然中天然的寶藏，是一種天然的抗生素，由覓食的蜜蜂從不同種類植物的芽和滲出物中收集樹脂物質(zhì)，與蜜蜂唾液中的β-糖苷酶混合而成，其主要成分是黃酮類化合物，具有較強(qiáng)的抗氧化特性以及調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)和腸道微生物群的能力〔4〕，是治療UC的一種候選藥物。本研究采用葡聚糖硫酸鈉（dextran sulfate sodium，DSS）建立UC大鼠模型，隨后接受“酗酒”模式，檢測酒精對DSS誘導(dǎo)的大鼠結(jié)腸炎癥的影響，同時評價水溶性蜂膠對酒精加重的UC發(fā)作時結(jié)腸炎癥的緩解作用并對其作用機(jī)制進(jìn)行初步探討，為UC患者飲酒安全提出可靠建議。

1 材料與方法

1.1 動物 雄性SD大鼠（SPF級）40只，體質(zhì)量180~200 g，購自濟(jì)南明悅實驗動物繁育有限公司，許可證號：SCXK（魯）20190003。實驗前4 d適應(yīng)性籠養(yǎng)于12 h/12 h光/暗循環(huán)環(huán)境中（室溫18~25℃，相對濕度50%~65%），室內(nèi)安靜，通風(fēng)正常，自由飲水和食用全價顆粒飼料。

1.2 試劑 水溶性蜂膠（純度>98%，廣州市杰禾蜂業(yè)有限公司，批號：20210325-B）；DSS（分子量：36 000~50 000 Da，美國Sigma公司，批號：S5036）；白細(xì)胞介素-6（IL-6）、白細(xì)胞介素-10（IL-10）、白細(xì)胞介素-17（IL-17）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）檢測試劑盒（均購自合肥博美生物科技有限責(zé)任公司，批號分別為：200-06；210-10；210-17；315-01a）；美沙拉嗪腸溶片（合肥市蜀山區(qū)潤吉化學(xué)試劑經(jīng)營部，批號：181003）。

1.3 主要儀器-80℃超低溫冰箱（Thermo公司）；倒置顯微鏡（Olympus公司）；Model-680酶標(biāo)儀（Biorad公司）；FA2004電子天平（天津天馬衡基儀器公司）。

1.4 分組、給藥及造模 將大鼠隨機(jī)分為5組，分別為對照組、UC組、UC+酒精組、UC+酒精+蜂膠組、UC+酒精+美沙拉嗪組，每組8只。UC+酒精+蜂膠組大鼠每天灌胃蜂膠溶液200 mg/kg，UC+酒精+美沙拉嗪組大鼠每天灌胃美沙拉嗪溶液50 mg/kg，其余各組每天灌胃等量蒸餾水，灌胃劑量0.2 mL/10 g，連續(xù)灌胃17 d。在給藥7 d后，對照組大鼠自由飲用蒸餾水，其余4組自由飲用4% DSS溶液，連續(xù)7 d。第15天，各組停止飲用DSS溶液，UC+酒精組、UC+酒精+蜂膠組、UC+酒精+美沙拉嗪組灌胃50%乙醇溶液，連續(xù)3 d，以模擬“酗酒”模式，其余組灌胃等量蒸餾水。第18天，將各組大鼠麻醉后頸椎脫臼處死。

1.5 結(jié)腸炎程度評估

1.5.1 疾病活動指數(shù)檢測 自開始飲用DSS溶液起（第0天），每天固定時間測量各組大鼠體質(zhì)量、糞便稠度及便血，計算疾病活動指數(shù)（disease activity index，DAI）：DAI=體質(zhì)量變化百分?jǐn)?shù)+糞便稠度分?jǐn)?shù)+便血分?jǐn)?shù)。評分標(biāo)準(zhǔn)依據(jù)文獻(xiàn)〔5〕。見表1。

表1 DAI評分標(biāo)準(zhǔn)

其中，大鼠體質(zhì)量變化百分?jǐn)?shù)計算公式：體質(zhì)量變化百分?jǐn)?shù)（%）=（（第X天體質(zhì)量-第0天體質(zhì)量）/第0天體質(zhì)量）×100%。使用隱血檢測試劑盒檢測大鼠便血情況，具體操作步驟參照試劑盒說明書。

1.5.2 結(jié)腸長度、質(zhì)量及結(jié)腸質(zhì)量指數(shù)檢測 大鼠處死后，沿腹中線切開大鼠腹部，暴露直腸，剪取直腸至回盲腸交界部的整段結(jié)腸，置于自制冰床上測量結(jié)腸長度；將結(jié)腸沿縱軸剖開，用預(yù)冷0.9%氯化鈉溶液沖洗，清理結(jié)腸內(nèi)容物，置于濾紙上吸干，測量結(jié)腸質(zhì)量；計算結(jié)腸質(zhì)量指數(shù)（%）=（結(jié)腸質(zhì)量/大鼠體質(zhì)量）×100%。

再取中段結(jié)腸0.5 cm，對每只大鼠的結(jié)腸組織進(jìn)行分析。其余結(jié)腸組織置于凍存管中，于-80℃冷凍保存。

1.5.3 結(jié)腸組織學(xué)評分（histological score，HS） 結(jié)腸標(biāo)本用4%多聚甲醛固定，95%乙醇脫水，石蠟包埋，制成5 μm切片，蘇木精-伊紅染色。依據(jù)文獻(xiàn)〔6〕在光學(xué)顯微鏡下觀察結(jié)腸黏膜的完整性、黏膜下炎性細(xì)胞浸潤的程度及腸壁腺體結(jié)構(gòu)的改變等，對腸道炎癥組織學(xué)損傷進(jìn)行評分，評分標(biāo)準(zhǔn)見表2。

表2 結(jié)腸組織學(xué)損傷評分標(biāo)準(zhǔn)

1.6 促炎因子和抗炎因子檢測 取出冷凍保存的結(jié)腸標(biāo)本，與0.9%氯化鈉溶液按1∶9比例混合，于自制冰床上充分研磨，直至勻漿液中僅有少量結(jié)締組織。將勻漿液移至離心管中，4℃下3 000 r/min離心30 min，離心半徑15 cm。取上清液，利用細(xì)胞因子特異性試劑盒進(jìn)行酶聯(lián)免疫吸附測定（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA），按照試劑盒使用說明書中步驟進(jìn)行操作，檢測結(jié)腸組織勻漿中促炎細(xì)胞因子IL-6，IL-17，TNF-α以及抗炎細(xì)胞因子IL-10的水平。

1.7 統(tǒng)計分析 所有統(tǒng)計分析均使用SPSS 25.0軟件進(jìn)行，結(jié)果以（±s）表示。多組間數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析，多組間兩兩比較根據(jù)方差是否齊性采用LSD法或Tamhane法，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠體質(zhì)量變化百分?jǐn)?shù)和DAI評分 第7天，停止飲用DSS溶液后，進(jìn)入UC緩解期。對照組大鼠體質(zhì)量穩(wěn)定增加，UC組、UC+酒精組大鼠體質(zhì)量均從第4天開始降低；與對照組比較，除第1天外，UC組、UC+酒精組、UC+酒精+蜂膠組、UC+酒精+美沙拉嗪組大鼠體質(zhì)量變化百分?jǐn)?shù)均降低，DAI評分增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。從第7天開始，接受DSS和酒精聯(lián)合處理的大鼠（UC+酒精組），與僅飲用DSS的大鼠（UC組）相比，體質(zhì)量下降更明顯，DAI評分進(jìn)一步增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。與UC+酒精組比較，使用水溶性蜂膠（UC+酒精+蜂膠組）和美沙拉嗪（UC+酒精+美沙拉嗪組）預(yù)處理的大鼠，體質(zhì)量變化百分?jǐn)?shù)明顯減少，且DAI評分降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。提示DSS成功建立UC大鼠模型，酒精可加重UC發(fā)作，加劇結(jié)腸炎癥，水溶性蜂膠和美沙拉嗪可緩解酒精加重的UC發(fā)作，減輕結(jié)腸炎癥。見表3~4。

表3 各組大鼠體質(zhì)量變化百分?jǐn)?shù)（%，±s）

表3 各組大鼠體質(zhì)量變化百分?jǐn)?shù)（%，±s）

注：與對照組比較*P<0.05，**P<0.01；與UC組比較## P<0.01；與UC+酒精組比較ΔP<0.05，ΔΔP<0.01。

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表4 各組大鼠DAI評分（±s）

表4 各組大鼠DAI評分（±s）

注：與對照組比較*P<0.05，**P<0.01；與UC組比較## P<0.01；與UC+酒精組比較ΔP<0.05，ΔΔP<0.01。

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2.2各組大鼠結(jié)腸長度、結(jié)腸質(zhì)量、結(jié)腸質(zhì)量指數(shù)和HS與對照組比較，UC組、UC+酒精組、UC+酒精+蜂膠組、UC+酒精+美沙拉嗪組大鼠結(jié)腸長度明顯縮短（P<0.01），結(jié)腸質(zhì)量（除UC+酒精+美沙拉嗪組外）均明顯升高（P<0.01），結(jié)腸質(zhì)量指數(shù)均明顯升高（P<0.01），HS均明顯升高（P<0.01）。與UC組比較，UC+酒精組大鼠結(jié)腸長度進(jìn)一步縮短（P<0.01），結(jié)腸質(zhì)量、結(jié)腸質(zhì)量指數(shù)及HS均進(jìn)一步升高（P<0.01）。與UC+酒精組比較，UC+酒精+蜂膠組和UC+酒精+美沙拉嗪組大鼠的結(jié)腸質(zhì)量、結(jié)腸質(zhì)量指數(shù)和HS均降低（P<0.05），結(jié)腸長度增加（P<0.05）。見圖1。結(jié)果提示“酗酒”模式后，酒精加重結(jié)腸損傷，UC癥狀惡化，水溶性蜂膠和美沙拉嗪對酒精加重的UC發(fā)作有一定治療效果。

圖1 各組大鼠結(jié)腸長度、結(jié)腸質(zhì)量、結(jié)腸質(zhì)量指數(shù)和HS

2.3 各組大鼠結(jié)腸組織勻漿中IL-6，IL-10、IL-17和TNF-α含量 結(jié)果顯示，與對照組比較，UC組、UC+酒精組、UC+酒精+蜂膠組、UC+酒精+美沙拉嗪組大鼠結(jié)腸組織中TNF-α和IL-17含量均顯著升高（P<0.01），IL-6含量（除UC+酒精+美沙拉嗪組外）均明顯升高（P<0.01），IL-10含量顯著降低（P<0.01）。與UC組比較，UC+酒精組大鼠結(jié)腸組織中IL-6，TNF-α和IL-17含量升高（P<0.01），IL-10含量降低（P<0.01）。與UC+酒精組比較，UC+酒精+蜂膠組、UC+酒精+美沙拉嗪組大鼠結(jié)腸組織中IL-6，TNF-α和IL-17含量降低（P<0.01），IL-10含量升高（P<0.01）。見圖2。

圖2 各組大鼠結(jié)腸組織勻漿中IL-6、IL-10、IL-17和TNF-α含量

3 討論

某些食物可以誘發(fā)或加重UC癥狀，這些食物在文獻(xiàn)中通常被稱為“觸發(fā)食物”〔7〕。其中，酒精與UC的發(fā)展和惡化有關(guān)，臨床數(shù)據(jù)也證實UC復(fù)發(fā)風(fēng)險增加與高濃度酒精攝入相關(guān)〔8〕。但目前很少有研究描述酒精對UC發(fā)作的影響。因此，本研究采用DSS誘導(dǎo)大鼠UC模型，隨后讓大鼠接受“酗酒”模式，探究酒精是否加重UC癥狀。美沙拉嗪是一種治療UC的常用藥物，可顯著抑制結(jié)腸炎癥，但其副作用較多，尋找新的替代藥物尤為重要。蜂膠是一種黏性天然化合物，是一種天然的抗生素，已被廣泛用作食品補(bǔ)充劑，自古埃及時代以來，它一直被用于治療各種炎癥性疾病。蜂膠含有400多種化學(xué)物質(zhì)，包括萜類、多酚、類黃酮等，具有多種生物學(xué)功能，包括抗炎和免疫調(diào)節(jié)等〔9〕。本研究對水溶性蜂膠緩解酒精加重UC發(fā)作的作用機(jī)制進(jìn)行了初步探索。

DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎是研究UC發(fā)作的成熟模型。該模型表現(xiàn)出許多與人類UC相似的癥狀，如：體質(zhì)量減輕、結(jié)腸縮短、腹痛、腹瀉、便血、腸黏膜潰瘍和促炎細(xì)胞因子產(chǎn)生增加等。文獻(xiàn)〔10〕中使用3%~5% DSS溶液誘導(dǎo)大鼠UC模型，本實驗中為區(qū)別單獨使用DSS及DSS和酒精聯(lián)合使用導(dǎo)致結(jié)腸炎癥損傷的微小差別，使用4%的DSS溶液，使用DSS處理的SD大鼠（UC組）表現(xiàn)出體質(zhì)量減輕、DAI評分升高，結(jié)腸長度縮短，結(jié)腸質(zhì)量指數(shù)升高及HS升高等一系列UC癥狀，表明UC模型制備成功。與UC組相比，UC+酒精組大鼠體質(zhì)量及結(jié)腸長度進(jìn)一步降低，DAI評分、結(jié)腸質(zhì)量指數(shù)、HS進(jìn)一步升高。結(jié)果表明，在DSS誘導(dǎo)大鼠結(jié)腸炎后，再經(jīng)歷“酗酒”模式，可明顯加重結(jié)腸炎癥。Bishehsari等〔11〕認(rèn)為酒精可能通過多種途徑誘發(fā)腸道炎癥，其中腸黏膜免疫系統(tǒng)破壞發(fā)揮重要作用，且在活動性腸道炎癥情況下，繼續(xù)飲酒會加重疾病活動。

貫穿整個胃腸道的促炎和抗炎細(xì)胞因子之間的微妙平衡對于健康的腸黏膜屏障功能和穩(wěn)態(tài)至關(guān)重要。免疫耐受性的破壞是UC的一個重要標(biāo)志〔12〕。大量證據(jù)表明，UC主要是由于固有層T淋巴細(xì)胞的激活不當(dāng)所致，當(dāng)幼稚T淋巴細(xì)胞與抗原呈遞細(xì)胞（antigen presenting cells，APC）接觸時，它們有可能被激活并分化為T淋巴細(xì)胞亞群，包括輔助性T淋巴（helper T，Th）1、Th2、Th17細(xì)胞和調(diào)節(jié)性T（regulatory T，Treg）細(xì)胞。近期發(fā)現(xiàn)Th17細(xì)胞與許多免疫炎癥性疾病有關(guān)，并且在UC進(jìn)展中的重要性已經(jīng)被證實；Treg細(xì)胞具有免疫調(diào)節(jié)功能，促進(jìn)免疫耐受，具有抗炎作用，在抑制免疫反應(yīng)和維持免疫耐受方面發(fā)揮重要作用。故Th17細(xì)胞的過度反應(yīng)和Treg細(xì)胞的功能不足與UC發(fā)作有關(guān)〔13〕。

IL-17是一種由Th17細(xì)胞產(chǎn)生的促炎細(xì)胞因子，它可以激活信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3），從而刺激強(qiáng)烈的慢性免疫炎癥反應(yīng)，它在腸道炎癥部位充當(dāng)促炎反應(yīng)的觸發(fā)器〔14〕，在炎癥反應(yīng)期間招募T淋巴細(xì)胞到固有層，導(dǎo)致腸道免疫系統(tǒng)過度激活，觸發(fā)了一系列的細(xì)胞內(nèi)事件，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡、細(xì)胞浸潤和腸黏膜結(jié)構(gòu)完整性和功能喪失，從而促進(jìn)腸道炎癥，而抑制Th17可以有效減少急性結(jié)腸炎的發(fā)展。由于Th17細(xì)胞在腸道炎癥中起著關(guān)鍵作用，因此有人提出促炎細(xì)胞因子IL-17可能是調(diào)節(jié)腸道炎癥反應(yīng)的治療靶點。本研究發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，UC組大鼠結(jié)腸組織中IL-17水平升高；與UC組相比，UC+酒精組大鼠結(jié)腸組織中IL-17水平進(jìn)一步升高；而與UC+酒精組相比，UC+酒精+蜂膠組大鼠結(jié)腸組織中IL-17水平降低，說明在活動性炎癥疾病期間，攝入酒精可提高促炎細(xì)胞因子IL-17水平，加劇腸道炎癥；水溶性蜂膠靶點Th17細(xì)胞，降低IL-17水平，發(fā)揮抗炎作用，改善酒精加重的UC發(fā)作，蜂膠的抗炎特性主要是由于它的類黃酮成分。Khosravi等〔15〕報道，煙曲霉分生孢子是最常見的室內(nèi)真菌過敏原，可增加促炎細(xì)胞因子IL-17的釋放誘導(dǎo)過敏性哮喘，蜂膠提取物可降低IL-17的水平，有效緩解哮喘發(fā)作。巴西蜂膠乙醇提取物對膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎（collagen-induced arthritis，CIA）發(fā)病機(jī)制的保護(hù)作用與抑制CIA小鼠中IL-17水平有關(guān)〔16〕。

幼稚T淋巴細(xì)胞向Th17細(xì)胞分化受到高濃度促炎細(xì)胞因子IL-6的調(diào)節(jié)，被IL-6激活的STAT3是參與Th17分化的關(guān)鍵信號分子，Th17細(xì)胞可分泌促炎細(xì)胞因子，如IL-17和TNF-α，在腸道炎癥中發(fā)揮致病作用。我們同樣檢測了各組結(jié)腸組織中IL-6和TNF-α的水平，結(jié)果表明UC組和UC+酒精組IL-6、TNF-α的發(fā)生趨勢與IL-17一致，促炎細(xì)胞因子的過量產(chǎn)生可導(dǎo)致活動性炎癥〔17〕。與UC+酒精組相比，UC+酒精+蜂膠組的IL-6、TNF-α水平下降趨勢與IL-17也一致，說明蜂膠可抑制促炎細(xì)胞因子IL-6、TNF-α的產(chǎn)生，這與文獻(xiàn)報道蜂膠在體外抑制IL-6誘導(dǎo)的Th17細(xì)胞分化，抑制IL-6誘導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和STAT3的磷酸化，在炎癥免疫性疾病中發(fā)揮抗炎作用一致〔18〕。說明蜂膠對Th17細(xì)胞分化的抑制作用有助于控制UC中的細(xì)胞因子穩(wěn)態(tài)不平衡，從而發(fā)揮抗炎作用。

與對照組相比，UC組大鼠結(jié)腸組織中IL-10水平降低；與UC組相比，UC+酒精組大鼠結(jié)腸組織中IL-10水平進(jìn)一步降低。IL-10是一種有效的抗炎細(xì)胞因子，由Treg細(xì)胞分泌。Treg細(xì)胞是T細(xì)胞的一個特殊子集，具有免疫調(diào)節(jié)功能，能促進(jìn)免疫耐受和抗炎，在抑制免疫反應(yīng)和維持免疫耐受方面發(fā)揮重要作用〔19〕。文獻(xiàn)〔20〕報道IL-10的缺失會導(dǎo)致腸道炎癥，而缺乏IL-10受體的Treg細(xì)胞更容易發(fā)生結(jié)腸炎。Treg細(xì)胞通過降低Th17相關(guān)細(xì)胞因子的表達(dá)預(yù)防腸道炎癥。IL-10還可以直接抑制CD4+Th的促炎細(xì)胞因子的表達(dá)，并通過APC抑制趨化因子的表達(dá)〔21〕。IL-10缺陷小鼠發(fā)生自發(fā)性IBD，其特征是存在由淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞組成的炎癥浸潤〔19〕。故推測在活動性結(jié)腸炎期間，攝入大量酒精，抑制Treg細(xì)胞分泌抗炎細(xì)胞因子IL-10，加重UC期結(jié)腸炎癥。與UC+酒精組大鼠比較，UC+酒精+蜂膠組大鼠結(jié)腸組織中IL-10水平升高，推測蜂膠可通過提高抗炎細(xì)胞因子IL-10水平，在UC發(fā)作期間對結(jié)腸黏膜起保護(hù)作用。有文獻(xiàn)〔22〕報道，蜂膠可通過Jak/Stat途徑下調(diào)核因子-кB途徑，進(jìn)而降低TNF-α、IL-8、IL-12、單核細(xì)胞趨化蛋白1、細(xì)胞間黏附分子1等的水平，調(diào)節(jié)先天和適應(yīng)性免疫反應(yīng)，發(fā)揮抗炎作用。

綜上所述，酒精加重UC的發(fā)作，是導(dǎo)致UC癥狀持續(xù)存在的潛在因素。水溶性蜂膠可以通過降低結(jié)腸組織中促炎細(xì)胞因子IL-6、IL-17、TNF-α水平，提高抗炎細(xì)胞因子IL-10的水平，控制UC中細(xì)胞因子穩(wěn)態(tài)的不平衡，從而緩解酒精加重的UC發(fā)作。