哺乳動物線粒體DNA轉錄調控機制的研究進展

熊 偉，劉如愛，李 彬，張本斯，姜 北，余 敏

（1.大理大學基礎醫學院，云南大理 671000；2.云南省高校臨床生物化學檢驗重點實驗室，云南大理 671000；3.云南省滇西抗病原植物資源篩選研究重點實驗室，云南大理 671000；4.云南大學生命科學學院，昆明 650091）

由于線粒體在人類健康和疾病中發揮著重要作用，近年來對線粒體DNA（mitochondrial DNA，mtDNA）的轉錄過程及調控機制的研究取得了許多重要的進展。目前，mtDNA體內和體外轉錄系統的基本組成部分已經基本確定，主要包括線粒體RNA聚合酶（mitochondrial RNA polymerase，POLRMT）、線粒體轉錄因子A（mitochondrial transcription factor A，TFAM）、線粒體轉錄因子B1（mitochondrial transcription factor B1，TFB1M）、線粒體轉錄因子B2（mitochondrial transcription factor B2，TFB2M）、線粒體轉錄延長因子（mitochondrial transcription elongation factor，TEFM）、線粒體單鏈結合蛋白（mitochondrial single-stranded binding protein，mtSSBP）和線粒體轉錄終止因子（mitochondrial transcription termination factors，mTERFs）家族〔1〕。此外，39 S線粒體核糖體蛋白L12（mitochondrial ribosomal protein L12，MRPL12）作為與POLRMT和TEFM結合的復合物，是轉錄延伸階段持續合成和防止在保守序列塊（conserved sequence block，CSB）2處轉錄終止所必需的〔2〕。在mtDNA的轉錄過程中，除了轉錄系統的基本組成部分發揮轉錄調控作用外，一些核轉錄因子也可以通過直接或間接的方式對mtDNA轉錄調控進行調節。本文主要從mtDNA的結構、轉錄過程及調控機制等方面進行綜述，重點介紹各種轉錄因子以及調控轉錄的其他重要因素在mtDNA的轉錄起始、延伸和終止過程中發揮的作用。

1 線粒體DNA的結構

線粒體基因組于1960年首次被描述〔3〕，并于1981年由Anderson等人完成測序〔4〕。鑒于其共生細菌的起源，線粒體基因組與細菌DNA的結構極其相似。細菌基因組被壓縮為其體積的10-4以形成類核，線粒體基因組以類似的方式將DNA組織壓縮形成離散的蛋白質-DNA復合物，分布于整個線粒體基質中〔5〕。每個線粒體類核中包含2~10個拷貝的mtDNA，可以被認為是線粒體中一個獨立的遺傳單位。哺乳動物mtDNA基因序列中幾乎沒有內含子，且mtDNA沒有組蛋白結合。存在類核中的蛋白質（例如TFAM等），實現了mtDNA的緊密包裝〔6〕。在大多數哺乳動物細胞中，mtDNA占總DNA的0.1%~2.0%。人類mtDNA是環狀的，全長16 569 bp，遺傳方式為母系遺傳。它編碼2種rRNA、22種tRNA和13種蛋白質，都參與氧化磷酸化過程〔7〕。根據mtDNA兩條鏈轉錄RNA在變性氯化銫（CsCl）密度梯度離心的不同，可將其分為重鏈（H鏈）和輕鏈（L鏈）〔8〕。其中，H鏈包含大部分的線粒體編碼基因，L鏈僅編碼MT-ND6蛋白和8個tRNA。

2 mtDNA的轉錄

與核基因組的轉錄機制完全不同，mtDNA轉錄的基本酶促機制由少數蛋白質組成：POLRMT是一種具有啟動子識別功能的單亞基聚合酶，它包含一個催化性C端結構域（C-terminal domain，CTD）和1個N端結構域（N-terminal domain，NTD）。但是，POLRMT不能單獨啟動依賴于啟動子的轉錄，因為它需要2個額外的轉錄因子：TFAM和TFB2M的協助。在非編碼的D環區，線粒體的轉錄受到一系列順式作用元件的調節，包括：重鏈啟動子（heavy strand promoter，HSP）1和HSP2、輕鏈啟動子1（light strand promoter 1，LSP1）、轉錄終止相關序列（termination related sequence，TAS）1和TAS2，以及保守序列塊（conservative sequence block，CSB）1、CSB2和CSB3。見圖1。在L鏈的轉錄過程中，LSP1是一個獨特的轉錄起始位點，其轉錄可以在CSB1處終止，但大多數的轉錄在啟動子下游200 bp處的CSB2處終止〔9〕。CSB2是1個富含G的保守序列，其功能是終止用于mtDNA復制的7 S RNA引物的轉錄，在調節mtDNA復制和轉錄之間的轉換中發揮重要作用〔9-10〕。在對H鏈轉錄的研究過程中，研究者們曾提出過H鏈雙啟動子系統來解釋2種rRNA的高豐度，其中HSP1轉錄產生包含tRNAPhe、tRNAVal和2個rRNA（12 S和16 S）的轉錄本，而HSP2產生的轉錄本幾乎跨越整個基因組。然而，最近的動物模型〔11〕和體外實驗〔12〕表明，H鏈的轉錄可能僅僅受單個啟動子的控制，rRNA表達豐度的差異可能是不同轉錄本周轉的結果。HSP2存在與否及其功能意義仍然是有待解決的問題。

圖1 線粒體DNA的D環控制區結構示意圖

mtDNA的轉錄由TFAM與轉錄起始位點-15~-10 bp處的高親和力位點結合而啟動，然后產生穩定的U形轉彎〔13〕，此時POLRMT就可以直接將蛋白質募集到啟動子的TFAM處結合。POLRMT可以在DNA中大約-60~-50 bp的位置滑動，直到TFB2M與復合物TFAM-POLRMT結合并且完全組裝成起始復合物包圍啟動子，才可以啟動該過程。值得注意的是，TFB2M、TEFM與POLRMT之間的結合并不兼容，在線粒體轉錄起始階段，TEFM無法與POLRMT結合。一旦POLRMT切換到延伸模式，轉錄起始因子被釋放，TEFM才能與POLRMT的CTD相互作用，促進轉錄形成較長的RNA片段，并在體內外均能提高mtDNA轉錄延伸的效率和活性。研究已經證明，TFAM的水平直接控制mtDNA的拷貝數〔14〕。除了轉錄激活作用外，它還將DNA包裹在類核中。在所有參與mtDNA轉錄調控的基因中，TFAM是一種已被證明突變會導致人類疾病的基因。TFAM基因突變與常染色體隱性遺傳病有關，嬰兒發病時伴有進行性肝功能衰竭。此外，有研究者在小鼠模型中發現高水平的TFAM會導致小鼠出生后死亡率升高和線粒體功能障礙，抑制哺乳動物mtDNA的轉錄〔15〕。TEFM可以刺激POLRMT與DNA∶RNA模板的相互作用，并繞過具有二級結構（如tRNA）的區域。最近的研究〔16〕證明，TEFM能夠通過減少POLRMT停頓的頻率和縮短其持續時間來增強mtDNA的轉錄延長，并有助于跨越CSB2序列以繼續轉錄成完整的多順反子RNA。

線粒體轉錄終止的過程仍不清楚。雖然MTERF1轉錄終止的原始模型提出它負責終止HSP2驅動的轉錄以促進rRNA的合成，但這些模型沒有任何體內證據支持。還有研究〔11〕表明，敲除小鼠的MTERF1基因對小鼠的表型以及rRNA和mRNA的水平沒有任何顯著影響，然而，生化研究表明MTERF1僅部分終止H鏈轉錄，而L鏈轉錄幾乎完全被阻斷。MTERF1似乎在LSP終止之外發揮作用，它已被證明可以通過POLRMT介導更普遍的RNA轉錄終止以及mtDNA的復制終止〔12，17〕。雖然MTERF1可能導致LSP終止，但HSP轉錄終止似乎與MTERF1無關，可能涉及其他蛋白質，這仍然是一個有待闡明的問題。

3 直接結合的蛋白質對mtDNA轉錄的調控

除了上述這些線粒體轉錄因子外，多項研究表明，許多不同的蛋白質如激素、核轉錄因子和染色質重塑酶，它們可以通過與mtDNA和RNA/DNA修飾酶發生相互作用來參與mtDNA轉錄的調節。

3.1 激素 最早發現參與mtDNA轉錄調控的蛋白質之一是甲狀腺激素（thyroid hormone，TH）。TH調節的基因表達由結合甲狀腺激素受體（thyroid hormone receptor，TR）與甲狀腺激素反應元件（thyroid hormone response element，TRE）來介導，它能通過直接結合mtDNA基因來促進mtDNA的轉錄〔18〕。最近觀察到甲狀腺激素能夠結合于12 S rRNA基因和D環區域中的TR〔19-20〕。研究還發現cAMP反應元件結合蛋 白（cAMP response element binding protein，CREB）能夠特異性結合天然形式或回文結構的TRE。此外，該蛋白質可以與位于線粒體基因組D環中的同向重復序列-2特異性結合。有研究發現，在心肌細胞的線粒體中存在雌激素受體（estrogen receptor，ER），因此推測E2（17β-雌二醇）和ERβ介導的心臟保護作用依賴于有mtDNA轉錄編碼的線粒體呼吸鏈活性維持。研究還證明E2可以增加ERβ的mtDNA結合活性，然后增加呼吸鏈復合體V編碼基因的表達〔21〕。還有研究表明〔22〕，糖皮質激素（glucocorticoid，GC）存在于線粒體中，可以與位于線粒體內膜中的糖皮質激素受體（glucocorticoid receptor，GR）結合。Psarra等〔23〕首次鑒定出GR和雌激素反應元件具有部分序列同源性，提出類固醇受體在mtDNA轉錄調控中具有潛在的作用。但目前尚不清楚GR是否與線粒體轉錄起始因子（TFAM、TFB2M或POLRMT）或其他已知的線粒體轉錄調節因子（如MTERF蛋白）相互作用。褪黑激素（melatonin，MT）是一種發揮重要抗腫瘤作用的松果體激素，線粒體是MT的已知靶標。在膠質母細胞瘤的研究中發現，TFAM的蛋白質水平與膠質瘤的惡性程度正相關，而MT影響TFAM的表達，MT能夠在mRNA和蛋白質水平上降低TFAM以及其他蛋白質的表達（如TFB1M和TFB2M），從而干擾mtDNA轉錄〔24〕。見表1。

表1 調控mtDNA轉錄的激素

3.2 核轉錄因子 線粒體有自身的環狀基因組DNA，有線粒體特異性轉錄和復制系統以及相應的調節蛋白。這些蛋白質都在核基因組編碼，翻譯后輸入線粒體。Marinov等〔25〕通過對7種不同的人類細胞系進行染色質免疫沉淀（ChIP）測序證明存在多種與mtDNA結合的核轉錄因子。結果表明，含量最豐富的是CEBPb、c-Jun、JunD、MafF、MafK、Max、NFE2和Rfx5，且它們中的大多數和預期一樣在D環區域中富集，但也能發現一些能夠在氧化磷酸化（oxidative phosphorylation，OXPHOS）亞基附近結合的序列，且在不同的細胞系之間存在差異。其中的一些轉錄因子已被證實在調節mtDNA轉錄方面的功能。

核轉錄因子c-Jun可以與其他涉及類視黃醇X受體（retinoid X receptor，RXR）途徑的酶協同減少mtDNA的轉錄〔26〕。活化T細胞的核轉錄因子（nuclear factor of activated T-cells，cytoplasmic 1，NFATc1）參與人骨髓間充質干細胞在成骨細胞中的分化。該蛋白質位于線粒體中并與D環區域相互作用，從而抑制一些關鍵基因的轉錄，例如細胞色素b（cytochrome b，Cyt b）和NADH-泛醌氧化還原酶鏈1（NADH-ubiquinone oxidoreductase chain 1，ND1）。研究表明〔27〕，NFATc1在鈣化過程中充當mtDNA轉錄的負調節因子。

3.3 染色質重塑酶 在真核生物中，核DNA（5mCpG）中CpG序列處的胞嘧啶甲基化和組蛋白修飾是影響基因轉錄的兩大因素。但是，mtDNA缺乏核小體染色質和組蛋白，這些CpG島在線粒體中的甲基化機制仍然未知。

TFAM是一種含量豐富且高度保守的高遷移率族（high-mobility-group box，HMG box）蛋白。類似于組蛋白對核DNA或細菌中組蛋白樣蛋白質的作用，TFAM是mtDNA類核中唯一明確的發揮結構作用的轉錄因子，且與mtDNA永久相關。這種蛋白質可能是造成mtDNA緊密包裝的主要因素，因此它在mtDNA的拓撲異構中發揮作用〔27〕。研究表明，TFAM可以將DNA扭曲形成U形轉彎，這種U形轉彎與LSP的轉錄起始有關〔28〕。TFAM可以結合mtDNA的雙螺旋結構，但由于其濃度對于整個mtDNA的覆蓋來說太低，因此TFAM主要在mtDNA的中心區域充當包裝蛋白。據估計，一分子TFAM可以20 bp的固定間隔與mtDNA結合，但由于蛋白質作為同源二聚體，兩分子TFAM可以35~40 bp的間隔與mtDNA結合。盡管有研究認為TFAM與mtDNA的結合缺乏序列特異性，但一些研究提出了mtDNA結合的位點偏好，尤其是在體外傾向于結合G-四鏈體結構（G-quadruplex，GQP）〔29〕。

由于TFAM對mtDNA的緊密覆蓋以及相互作用的非序列特異性，該蛋白質必須與mtDNA中的許多CpG島相互作用。越來越多的證據表明，類似于細胞核中發生的情況，一些CpG島中可能發生甲基化從而影響mtDNA的轉錄修飾。Rebelo-Guiomar等〔30〕提出，5mCpG的出現有可能影響哺乳動物細胞中的TFAM-mtDNA識別。研究證實，HSP中CpG序列的甲基化可以增加TFAM在這些位點誘導TFAM多聚化的結合活性，但不會改變DNA的壓實。此外，研究表明HSP1啟動子中的CpG甲基化強烈增加了從該位點開始的轉錄。最近有人提出，結構化的成人染色質樣mtDNA組織是在哺乳動物胚胎發育過程中逐漸形成的，實現了mtDNA的動態覆蓋。事實上，在mtDNA中不僅可以發現CpG序列的甲基化，還可以發現不同的染色質重塑酶。

組蛋白乙酰轉移酶MOF（males absent on the first，MOF），也被命名為MYST1或KAT8，是主要的賴氨酸乙酰轉移酶（lysine acetyl transferase，KAT），負責果蠅和哺乳動物體內H4K16ac的沉積，是通過表觀遺傳學修飾連接核基因組以及線粒體基因組的雙重轉錄調節劑。MOF可以控制mtDNA的轉錄，而這種作用依賴于KANSL3〔31〕。當MOF/KANSL3缺失時，線粒體轉錄被顯著下調，嚴重影響細胞代謝和呼吸功能。相反，信號轉導及轉錄激活因子3（signal transduction and activator of transcription protein 3，STAT3）能夠結合mtDNA和TFAM，從而調節mtDNA的轉錄。已經證明，角質細胞中STAT3的缺失會導致線粒體編碼的基因轉錄物增加〔31〕。NAD依賴性蛋白脫乙酰酶Sirtuin-1（NADdependent protein deacetylase sirtuin-1，SIRT1）作為游離蛋白質存在于線粒體中，可以作為TFAM的調節因子并與之形成穩定的復合物。SIRT1可能影響其脫乙酰化和mtDNA的活性，從而調控mtDNA的轉錄〔32〕。DNA甲基轉移酶1（DNA methyltransferase 1，Dnmt1）是一種通常與基因沉默相關的甲基轉移酶。研究發現，Dnmt1在用高濃度葡萄糖處理的視網膜內皮細胞的線粒體中累積，D環區域的甲基化水平顯著增加，抑制mtDNA轉錄，導致線粒體功能障礙和細胞凋亡加速〔33〕。見表2。

表2 調控mtDNA轉錄的染色質重塑酶

3.4 線粒體微小RNA從細胞核轉移到線粒體的微小RNA（microRNA，miRNA）稱為線粒體miRNA（mitomiR），miRNA已經被證明是一類能夠通過干擾翻譯過程來調節基因表達的小RNA。研究發現了一類特定的mitomiR在線粒體附近和這些細胞器內富集來控制線粒體的行為。但目前尚不清楚mitomiRs是如何進入細胞器的，同時存在于基質和線粒體膜間隙中的一種核糖核酸酶——多核苷酸磷酸化酶（polynucleotide phosphorylase，PNPase）似乎是發揮此作用的主要蛋白質。有研究已經將mtDNA確定為mitomiRs的來源和靶標〔34-35〕。除了它們在翻譯抑制中的主要功能外，miRNA還涉及在特定條件下增強或抑制mtDNA轉錄。有研究已經證明了mitomiR-2392可以調節舌鱗狀細胞癌中mtDNA的基因表達。這種miRNA在線粒體中的存在能夠逆轉這些腫瘤細胞的化療抗性，通過與Argonaut2直接結合到mtDNA H鏈的特定序列，部分阻斷多順反子mtDNA的轉錄，導致OXPHOS復合物的活性降低〔36〕。Zhang等〔37〕研究發現，miR-1是一種在肌生成過程中特異性誘導的miRNA，它能有效地進入線粒體，直接增強肌肉分化過程中特定線粒體基因組編碼轉錄物的翻譯。

4 間接調控mtDNA轉錄的核轉錄因子

許多因素涉及線粒體轉錄調控和細胞核之間的聯系。核轉錄因子在間接控制mtDNA轉錄和線粒體功能中發揮著核心作用。目前研究最多的影響mtDNA轉錄的核蛋白是核呼吸因子（nuclear respiratory factor，NRF）NRF-1和NRF-2、轉錄阻遏蛋白陰陽1（ying-yang 1，YY1）、p53和過氧化物酶體增殖物激活受體γ共激活因子-1（peroxisome proliferator-activated receptor γ coactivator-1，PGC-1）等。見表3。

表3 直接調控和間接調控mtDNA轉錄的核轉錄因子

NRF-1和NRF-2控制的調節網絡從呼吸鏈亞基延伸到控制mtDNA轉錄和復制的組分，對mtDNA轉錄的關鍵酶的表達也有重要作用〔38〕。已有研究證明，它們能夠增強哺乳動物運動過程中線粒體生物發生基因的轉錄及對多種壓力的應激反應〔39-40〕。TFAM和mtRNA加工酶是NRF-1的靶基因。最近研究證明，TFB1M和TFB2M也是NRF-1的靶基因，兩者可以共同增強mtDNA的轉錄〔40〕。PGC-1和PGC-1相關共激活因子（PGC-1-related coactivator，PRC）的激活需要相同的NRF識別位點，這些PGC-1家族成員和PRC也是控制代謝、分化和細胞生長的生理信號轉導和整合以及mtDNA轉錄的重要因素〔41〕。PGC-1α是一種共轉錄調節因子，通過激活不同的轉錄因子（包括NRF-1和NRF-2）來調控mtDNA的轉錄〔42〕。YY1是PGC-1α的靶標之一，它與哺乳動物雷帕霉素靶標（mammalian target of rapamycin，mTOR）蛋白一起可以調節mtDNA的轉錄。PGC-1β與PGC-1α具有相似的分子結構和功能，可以調控核受體結合和轉錄激活〔43〕。與前兩個PGC-1家族成員一樣，PRC也能結合參與線粒體基因表達的核轉錄因子。此外，PRC可能顯著提高早期胚胎發生期間的線粒體基因轉錄效率〔42〕。線粒體呼吸鏈基因是PGC-1α和mTOR的共同靶標〔44〕。mTOR是一種激酶，是細胞中營養感應和能量通路的基本組成成分〔45〕。mTOR還有助于控制線粒體氧化活性，mTOR蛋白的抑制會導致骨骼肌細胞中的PGC-1α和NRFs的表達喪失，導致mtDNA表達減少和OXPHOS損傷。研究表明，這種功能是由YY1介導的，YY1是mTOR營養感應的重要組成部分。YY1基因沉默可以抑制mtDNA的表達和線粒體的呼吸功能〔44〕。

腫瘤抑制因子p53是一種關鍵的轉錄激活蛋白，被證明參與控制mtDNA的拷貝數。p53通過其核轉錄因子的活性來調節線粒體功能，增強細胞凋亡并抑制mtDNA突變。在原代小鼠和人類成纖維細胞中敲除p53導致mtDNA的消耗和TFAM的減少，從而間接影響mtDNA的轉錄、蛋白質合成和線粒體數量〔46〕。此外，p53可以抑制NF-κB家族成員RelA向線粒體的轉運。在沒有p53的情況下，RelA被轉運并被招募到線粒體基因組中，抑制mtDNA的表達、耗氧量和細胞ATP水平，這種功能是通過與線粒體轉錄因子的相互作用實現的〔47〕。

缺氧誘導因子-1α（hypoxia inducible factor-1，HIF-1α）是細胞對缺氧反應的關鍵轉錄因子，是調節線粒體功能的另一個關鍵因素。研究表明，HIF-1α減少了活性氧的產生并保持了線粒體對抗氧化應激的功能，HIF-1α在誘導人體細胞氧化應激后能夠在線粒體內易位。線粒體靶向形式的HIF-1α的過表達有助于減弱細胞凋亡并促進mtDNA編碼的mRNA的表達，而線粒體HIF-1α的異位表達下調了基質中mtDNA編碼的mRNA水平但不影響線粒體數量〔48〕。

線粒體基因轉錄的調控是非常獨特的，因為其受到mtDNA和核基因組的雙重調節。因此，調控線粒體基因表達更高級的機制是線粒體基因和編碼呼吸鏈復合蛋白質的核基因的共表達。兩種遺傳系統都可以根據細胞的能量需求來增強或減少轉錄。研究表明，存在于細胞核和線粒體中的5種OXPHOS復合體均存在基因的共表達機制。盡管確定了OXPHOS基因表達的相關模式，但在編碼OXPHOS復合物的基因核心啟動子內，仍沒有檢測到轉錄因子結合位點的特異性排列〔49〕。

5 總結與展望

綜上所述，隨著對哺乳動物mtDNA的轉錄及調控研究的不斷深入，人們對線粒體的轉錄調控機制有了更深入的認識，但仍然有許多具體的調控細節并不是非常清楚。長期以來，人們一致認為線粒體在細胞能量代謝中起著核心作用，但線粒體疾病發生發展的復雜機制尚有待進一步研究。通過對哺乳動物mtDNA的轉錄過程及調控機制的研究，將為闡明臨床上各種線粒體疾病的發病機制提供更多的理論依據，也為尋找線粒體基因診斷和基因治療提供新的方法和思路。