基于數(shù)據(jù)挖掘探究蘭艾雙香方誘導(dǎo)大腸桿菌K12菌株鐵死亡機(jī)制研究

張振華 宋 健 孟凱強(qiáng) 胥 冰 王 斌 沈舒文 張瑞凡 王紫慧 蘇 輝王 卓 馮天照陜西中醫(yī)藥大學(xué)，陜西咸陽 712046

隨著中藥藥理學(xué)對中藥有效成分及作用蛋白研究的不斷加深，中藥在抗菌、抑菌方面的顯著療效逐漸被展示。宋健副教授科研團(tuán)隊(duì)通過現(xiàn)代工藝技術(shù)，對名老中醫(yī)沈舒文教授的臨床經(jīng)驗(yàn)方劑—蘭艾雙香方，進(jìn)行了中藥新劑型改良，作為新型消毒劑。通過數(shù)據(jù)挖掘，檢索蘭艾雙香方的有效成分及對應(yīng)蛋白，建立數(shù)據(jù)庫并對其進(jìn)行分析，共獲得蘭艾雙香方蛋白265個(gè)；其中“MG1655”樣品中共有17個(gè)作用蛋白，“W3110”樣本中有5個(gè)作用蛋白，fhuA（ferrichrome outer membrane transporter）是在大腸桿菌K12抑菌過程中誘導(dǎo)大腸桿菌發(fā)生鐵死亡的關(guān)鍵蛋白，提示蘭艾雙香方中存在的鐵色素外膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在大腸桿菌鐵死亡進(jìn)程中發(fā)揮作用。為后續(xù)開展中醫(yī)藥抑菌、抗菌作用的研究提供了一定基礎(chǔ)。

隨著中藥藥理學(xué)的發(fā)展，對中藥有效成分及作用蛋白的開發(fā)和研究不斷加深，已證實(shí)如藤梨根、藿香、羌活、艾葉等中藥中的酚類、黃酮類、生物堿類、萜類等多種單體化合物有明顯抗菌作用。中藥在抑菌方面的療效十分顯著，劉繼敏等[1]開發(fā)的以苦參、蛇床子、甘草、冰片、薄荷腦為原料的奧膚舒消毒液主要針對白念珠菌、金黃色葡萄球菌和大腸桿菌，通過抑菌試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)其對以上三種常見致病菌有明顯抑制作用。馮立民等[2]開發(fā)的以苦參、蛇床子、大黃等水煎提取液加芳香油制成的消毒液在抑菌試驗(yàn)中對常見致病菌有明顯作用。冼桂江等[3]以中藥黃柏、蛇床子水煎提取液配合氯己定的懸濁液作為中藥消毒液通過在懸液定量殺菌試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)其有明顯的抑菌效果。蘭艾雙香抑菌消毒液是針對常見致病菌的抑菌消毒液，該消毒液是以抑菌中藥復(fù)方蘭艾雙香方為基礎(chǔ)，通過現(xiàn)代蒸餾提純等技術(shù)，在國家級大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)項(xiàng)目專項(xiàng)經(jīng)費(fèi)的支持下，設(shè)計(jì)并完成的中藥新劑型改良項(xiàng)目。其組成為羌活、獨(dú)活、石菖蒲、藿香、蒼術(shù)、丁香、薄荷、貫眾、苦杏仁、半枝蓮、佩蘭和艾葉，該方是名老中醫(yī)沈舒文教授與宋健副教授豐富中醫(yī)臨床經(jīng)驗(yàn)的凝練，多年來一直作為治療細(xì)菌感染的臨床基礎(chǔ)方。

鐵死亡（ferroptosis）是指主要依賴于細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)活性氧（L-ROS）和鐵累積所引起的細(xì)胞凋亡過程。Dolma等[4]在2003發(fā)現(xiàn)了一種不伴有細(xì)胞核形態(tài)改變、DNA斷裂以及半胱天冬酶激活的新細(xì)胞凋亡模式的新化合物“Erastin”，并且發(fā)現(xiàn)這一細(xì)胞凋亡過程不能被（如半胱天冬酶抑制劑等）凋亡抑制劑抑制。Dixon等[5]于2012年將該細(xì)胞凋亡過程正式命名為“鐵死亡”，是一種新的調(diào)節(jié)性細(xì)胞凋亡形式。促使細(xì)胞發(fā)生鐵死亡的誘導(dǎo)方式多種多樣，包括p53質(zhì)粒包裹金屬有機(jī)網(wǎng)絡(luò)的MON-p53[6]、納米氧化鐵[7]、FePt納米粒子[8]、酰基輔酶A合成長鏈家族成員4（ACSL4）[9-10]等。除此之外，相關(guān)方劑和中藥也可導(dǎo)致鐵死亡的發(fā)生，如黃芩湯、四物湯、淫羊藿、干姜、高良姜、麥冬、花椒、青蒿等。

本研究通過對蘭艾雙香方進(jìn)行分子層面的討論，探究其在大腸桿菌K12抑菌過程中誘導(dǎo)大腸桿菌K12鐵死亡的機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 數(shù)據(jù)來源

分別以“羌活、獨(dú)活、石菖蒲、藿香、蒼術(shù)、丁香、薄荷、貫眾、苦杏仁、半枝蓮、佩蘭和艾葉”十二種物質(zhì)檢索中國知網(wǎng)及中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺(tái)TCMSP（http://tcmspw.com/tcmsp.php）等，對蘭艾雙香方的有效成分及蛋白進(jìn)行收集整理。以“Iron Death”在Uniptot數(shù)據(jù)庫中搜索鐵死亡相關(guān)蛋白，該結(jié)果將作為鐵死亡的相關(guān)蛋白。

1.2 納入標(biāo)準(zhǔn)

①所選復(fù)方蘭艾雙香方蛋白對應(yīng)的有效成分需同時(shí)滿足口服生物利用度（OB）≥30%和類藥性（DL）≥0.18兩個(gè)條件；②鐵死亡相關(guān)蛋白需為大腸桿菌K12物種，剔除其他物種的鐵死亡相關(guān)蛋白；③所有組別的蛋白需刪除該組重復(fù)項(xiàng)內(nèi)容，多次出現(xiàn)按照一次計(jì)算，不做出現(xiàn)頻次的累積。

1.3 數(shù)據(jù)錄入和標(biāo)準(zhǔn)化

將所有涉及的蛋白質(zhì)名稱以及基因名稱進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理，運(yùn)用國際專用縮寫，如“Ferrichrome outer membrane transporter”“Ferric hydroxamate receptor”“Ferric hydroxamate uptake”“Ferrichromeiron receptor”“JW0146”統(tǒng)一規(guī)范為“fhuA”。

1.4 數(shù)據(jù)分析

運(yùn)用Excel及相關(guān)數(shù)據(jù)庫篩選蘭艾雙香方中對大腸桿菌鐵死亡起作用的蛋白，對特定蛋白的作用進(jìn)行分析。構(gòu)建蘭艾雙香方核心蛋白與其他蛋白之間的蛋白網(wǎng)絡(luò)，并分析其作用關(guān)系。

2 結(jié)果

2.1 活性化合物的篩選結(jié)果

利用TCMSP數(shù)據(jù)庫檢索共收集得到蘭艾雙香方的化學(xué)成分，根據(jù)OB≥30%和DL≥0.18為指標(biāo)進(jìn)行篩選，得到復(fù)方中共138個(gè)活性化學(xué)成分，包括羌活（15個(gè)）、獨(dú)活（9個(gè)）、石菖蒲（4個(gè)）、藿香（11個(gè)）、蒼術(shù)（9個(gè)）、丁香（6個(gè)）、薄荷（10個(gè)）、貫眾（7個(gè)）、苦杏仁（19個(gè)）、半枝蓮（28個(gè)）、佩蘭（11個(gè)）和艾葉（9個(gè)）的化學(xué)成分；結(jié)合相關(guān)數(shù)據(jù)庫將有效成分的對應(yīng)蛋白進(jìn)行整理，共獲得蘭艾雙香方蛋白265個(gè)。

2.2 藥物針對大腸桿菌K12作用蛋白篩選結(jié)果

將蘭艾雙香方265個(gè)蛋白導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫（https://cn.string-db.org/），物種選擇“Escherichia coli K12”兩個(gè)不同的樣本“MG1655”和“W3110”，分別獲得在兩種不同的大腸桿菌K12的作用蛋白，“MG1655”樣品中共有17個(gè)作用蛋白、“W3110”樣本中有5個(gè)作用蛋白，見圖1～2。

圖1 大腸桿菌K12（MG1655）

圖2 大腸桿菌K12（W3110）

2.3 鐵死亡過程中核心基因篩選

將蘭艾雙香方和大腸桿菌鐵死亡兩組蛋白準(zhǔn)備好后，導(dǎo)入Jvenn中，作出兩者的交集[11]，即為本研究核心蛋白，僅有1個(gè)核心蛋白—fhuA，fhuA蛋白是在大腸桿菌K12抑菌過程中誘導(dǎo)大腸桿菌發(fā)生鐵死亡的關(guān)鍵蛋白。

3 討論

fhuA蛋白為鐵色素外膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，與鐵鉻（一種異羥肟酸鹽型鐵載體）復(fù)合參與鐵的吸收，結(jié)合并轉(zhuǎn)運(yùn)鐵鉻鐵穿過外膜；除了在鐵色素-鐵轉(zhuǎn)運(yùn)中的作用外還可轉(zhuǎn)運(yùn)抗生素白霉素，是鐵色素的結(jié)構(gòu)類似物，并作為大腸桿菌素M、小菌素J25和噬菌體T1、T5、phi80和UC-1的受體[12-14]，其二級結(jié)構(gòu)和結(jié)構(gòu)示意圖見圖3～4。

圖3 fhuA二級結(jié)構(gòu)示意圖

圖4 fhuA結(jié)構(gòu)示意圖

蘭艾雙香方中多種中藥均有明顯抑菌作用，李美雎等[15]通過對比發(fā)現(xiàn)青海不同產(chǎn)地寬葉羌活均存在特異的抗菌活性，可作為寬葉羌活抗菌藥物開發(fā)物質(zhì)基礎(chǔ)。王小云等[16]通過抑菌試驗(yàn)發(fā)其化合物羌活揮發(fā)油對銅綠假單胞桿菌、大腸桿菌和金黃色葡萄球菌具有一定的抑制作用。劉杰等[17]發(fā)現(xiàn)佩蘭提取的黃酮成分對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和枯草桿菌等具有一定的抑菌作用。賀富胤等[18]通過試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)石菖蒲提取物對獼猴桃潰瘍病菌產(chǎn)生抑菌作用的較佳提取工藝，且同條件下，復(fù)配物有更強(qiáng)的抑菌作用。曾婷等[19]通過正交試驗(yàn)等發(fā)現(xiàn)佛手、艾葉、廣藿香和云木香配比為2∶1∶4∶2時(shí)，該配方具有良好抑菌效果，并且以該處方為基礎(chǔ)研發(fā)了一款新型抑菌香皂。蘭艾雙香方的藥物為具有抑菌作用的常用中藥，該方也是細(xì)菌感染的臨床常用方，在臨床中有明顯療效。

中藥可通過多種成分在多種途徑發(fā)揮抑菌作用，復(fù)雜的抑菌途徑難以明確其準(zhǔn)確的抑菌過程，本研究通過對大腸桿菌K12菌株的鐵死亡過程進(jìn)行研究，擬發(fā)掘蘭艾雙香方在催化大腸桿菌進(jìn)行鐵死亡過程中產(chǎn)生作用的蛋白。通過數(shù)據(jù)發(fā)掘的方式，發(fā)現(xiàn)蘭艾雙香方中存在的鐵色素外膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在大腸桿菌鐵死亡進(jìn)程中發(fā)揮作用，為后續(xù)開展誘導(dǎo)常見大腸桿菌等常見致病菌發(fā)生鐵死亡從而發(fā)揮抑菌作用提供了基礎(chǔ)。