改良化學沉淀法和過氧化物酶法檢測冠心病患者血清小而密低密度脂蛋白的方法學比較

解晨曦 畢 波

新疆醫科大學第五附屬醫院檢驗科，新疆烏魯木齊 830011

冠心病指由于冠狀動脈供血不足，致使心肌 壞死、缺血，導致心臟收縮力減弱、順應性降低等功能障礙類心血管疾病，已成為嚴重威脅患者生命安全的疾病之一[1-2]。低密度脂蛋白（low density lipoprotein，LDL）作為公認的冠心病危險因素，其在顆粒大小、密度與物理化學性質等方面具有異質性[3-4]。將其按照顆粒大小不同，可分為小而密LDL（small dense low density lipoprotein，sdLDL）和大而輕LDL（large and light low density lipoprotein，IbLDL）。sdLDL可作為冠心病的首要脂類危險因素[5]。當前sdLDL的檢驗方法包括梯度凝膠電泳法、密度梯度超速離心法、化學沉淀法和過氧化物酶法，但梯度凝膠電泳法分析速度慢，且操作繁瑣，密度梯度超速離心法所需時間長，且檢測儀器昂貴。本研究選擇應用較多的過氧化物酶法和肝素鎂沉淀法進行比較。但國內對肝素鎂沉淀法和過氧化物酶法檢測冠心病患者血清sdLDL的相關研究較少，基于此，本研究通過對82例冠心病患者sdLDL進行分析，探討肝素鎂沉淀法和過氧化物酶法的應用價值。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取82例新疆醫科大學第五附屬醫院2021年1—8月收治的冠心病患者，納入標準：①冠心病診斷參照《心血管內科學》[6]，經冠狀動脈造影確診為冠心??；認知功能正常者；依從性良好者；臨床資料完整者。排除標準：伴有高血壓致左心室肥厚者：合并持續性室速、房顫等嚴重心律失常者；合并嚴重感染性疾病者。其中男45例，女37例；年齡55～70歲，平均（62.56±4.67）歲；疾病類型：穩定型心絞痛31例，心肌梗死21例，不穩定型心絞痛30例。本研究全部冠心病患者簽署診療知情同意書，課題立項已獲得醫院醫學倫理委員會批準。

1.2 方法

入院后，對全部患者均行常規檢查，并記錄身體相關指標。抽取冠心病患者空腹靜脈血，進行離心（3500 r/min，15 min），分離血清，采用AU5800全自動生化分析儀（美國貝克曼，粵械注準：20162220214），三酰甘油（triacylglycerol，TG）與總膽固醇（total cholesterol，TC）使用貝克曼試劑，LDL使用上海藍怡試劑，sdLDL-C過氧化物酶法使用寧波美康生物試劑（批號：085813），相關步驟嚴格按照試劑說明書進行。sdLDL-C過氧化物酶法使用特定的離子選擇劑和酶，并排除其他脂蛋白膽固醇的干擾，和特定的sdLDL-C選擇性反應。首先，在離子選擇劑作用下，對sdLDL-C以外的脂蛋白選擇性抑制，并將非sdLDL-C成分清除干凈。使sdLDL-C在膽固醇氧化酶與膽固醇酯酶作用下，生成過氧化氫，并在過氧化物酶作用下，和色原生成紫紅色酶類物質，進而檢驗sdLDL-C水平。取3 μl血清，與150 μl試劑1[膽固醇酯酶1.5 KU/L，磷酸鹽緩沖液100 mmol/L，磷脂酶2.5 KU/L，膽固醇氧化酶1 KU/L，過氧化物酶6 KU/L，N-乙基-N-（2-羥基3-磺丙基）3-甲基苯胺鈉鹽1.78 mmol/L，1-丁基-3甲基咪唑六氟磷酸鹽0.1 ml/L]混勻，37° C孵育5 min，讀取吸光度。并與50 μl試劑2（4-氨基安替比林2.5 mmol/L，磷酸鹽緩沖液100 mmol/L，乙二按四乙酸50 mmol/L）混勻，37℃孵育5 min，讀取吸光度，計算sdLDL-C。

肝素鎂沉淀法：將200 μl肝素鎂沉淀劑與200 μl血清加入離心管中，混合均勻，在37℃條件下，水浴10 min，隨后冰浴15 min。在4℃條件下進行離心處理（16 600 r/min，15 min）。通過全自動生化分析儀檢驗上清液LDL-C濃度，即為血清sdLDL-C濃度。

1.3 觀察指標及評價標準

①sdLDL-C精密度分析：選擇sdLDL-C濃度為2.57、1.42、0.21 mmol/L高、中、低水平的樣品各1份，每日檢測2次，每次均檢測2遍，共檢測20 d。根據美國國家臨床實驗室標準化委員會（NCCLS）EP5-T2文件[7]評價精密度。②線性分析：取1高值標本（sdLDL-C濃度為2.56 mmol/L）和1低值標本（sdLDL-C濃度為0.15 mmol/L），等量混勻后，制備為中值標本（sdLDL-C濃度為1.36 mmol/L），將中值標本分別與高、低值標本等量混勻后，制備的sdLDL-C濃度分別為1.96、0.76 mmol/L。將上述5個標本分別使用肝素鎂沉淀法和過氧化物酶法測定4次，根據NCCLS（EP6-P）的相關評價方案進行線性分析。③肝素鎂沉淀法和過氧化物酶法測定sdLDL-C水平的結果：選擇患者血清82份，sdLDL-C濃度為0.10～2.59 mmol/L，分別使用肝素鎂沉淀法和過氧化物酶法檢測sdLDL-C水平，并根據NCCLS（EP9-P）評價方案進行方法學比較。

1.4 統計學方法

結果數據納入SPSS 22.0統計學軟件進行分析，計量資料以均數±標準差（x±s）表示，采用t檢驗，多個樣本均數間比較用方差分析；計數資料以[n（%）]表示，采用χ2檢驗，P< 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 肝素鎂沉淀法和過氧化物酶法檢測sdLDL-C精密度分析

過氧化物酶法和肝素鎂沉淀法檢測sdLDL-C，批間、批內、總變異系數均<2.972%，精密度較好，見表1。

表1 改良化學沉淀法和過氧化物酶法檢測sdLDL-C精密度分析（n=43）

2.2 線性分析

線性回歸方程分別為肝素鎂沉淀法：Y=0.973X+0.025；過氧化物酶法：Y=0.991X+0.023，sdLDL-C水平處于0.10～2.59 mmol/L時，線性良好，肝素鎂沉淀法與過氧化物酶法均有良好的相關性，且呈正直線關系（P< 0.05）。

2.3 肝素鎂沉淀法和過氧化物酶法測定sdLDL-C水平的結果比較

肝素鎂沉淀法和過氧化物酶法測定sdLDL-C水平（TG值<4.0 mmol/L）結果表明，過氧化物酶法測定sdLDL-C水平為（1.18±0.19）mmol/L，肝素鎂沉淀法測定sdLDL-C水平為（1.21±0.20）mmol/L，差異無統計學意義（t=0.137，P=0.856）。

3 討論

冠心病的病機較為復雜，其中血栓形成和心血管動脈粥樣硬化在冠心病演變過程中具有重要作用，脂類代謝紊亂為常見表現[8-9]。血清LDL是動脈粥樣硬化發生發展的危險因素，隨著研究的逐漸深入，sdLDL作為LDL亞組之一，已成為脂質代謝的研究重點，其與冠心病密切相關[10-11]。因此，檢測血清sdLDL-C對冠心病的診治具有重要作用[12-13]。

sdLDL-C作為LDL-C的主要成分，半衰期較長，和sdLDL-C受體親和性不高，對患者血管壁侵入性較高，且對氧化應激耐受性較低，可作為冠心病的獨立危險因子[14-15]。肝素鎂沉淀法作為一種通過投加肝素鎂沉淀劑，使血液中需要去除的溶解物質轉化為難溶物質而析出的處理方式，和傳統化學沉淀法相比，具有樣本用量少、無需特殊儀器、價格低廉和操作簡單等優點，更適用于血清sdLDL-C水平檢測[16]。而過氧化物酶法檢測使用特定的離子選擇劑和酶，并排除其他脂蛋白膽固醇的干擾，和特定的sdLDL-C選擇性反應，后使用酶法定量檢測其含量。優點在于可直接檢測sdLDL-C，受其他脂蛋白膽固醇干擾小，同時不含鎂離子，對儀器基本沒有損傷，適用于多種生化分析儀[17]。本研究結果顯示，過氧化物酶法和肝素鎂沉淀法檢測sdLDL-C，批間、批內、總變異系數均<2.972%，精密度較好，提示過氧化物酶法檢測冠心病患者血清sdLDL-C的精密度較高，有利于為冠心病的診治和預后評估，為其提供相應參考依據[18]，線性回歸方程分別為肝素鎂沉淀法：Y=0.973X+0.025，過 氧 化 物 酶 法：Y=0.991X+0.023，sdLDL-C水 平處于0.10～2.59 mmol/L時，線性良好，肝素鎂沉淀法與過氧化物酶法均有良好的相關性，且呈正直線關系（P< 0.05），提示過氧化物酶法與肝素鎂沉淀法相比較，TG值<4.0 mmol/L時，對于結果檢測的相關性良好，而TG值>4.0 mmol/L時，不利于使用F計算法。肝素鎂沉淀法和過氧化物酶法測定LDL-C水平（TG值<4.0 mmol/L）結果比較，差異無統計學意義（P> 0.05），提示TG值<4.0 mmol/L時，肝素鎂沉淀法和過氧化物酶法測定結果均不受TG值影響，TG值>4.0 mmol/L時，肝素鎂沉淀法和過氧化物酶法測定結果有一定差異。通過肝素鎂沉淀法和過氧化物酶法檢測冠心病患者血清sdLDL-C，有利于為臨床提供可靠的檢驗數據，進而指導冠心病篩查與治療。但本研究仍存在不足之處，如研究樣本數量較少，不能對肝素鎂沉淀法和過氧化物酶法檢測冠心病患者sdLDL-C的精密度做出準確判斷，因此，臨床可擴大樣本數量進行研究，以進一步提高研究結果的準確性。

綜上，肝素鎂沉淀法和過氧化物酶法的相關性良好，對于冠心病患者血清sdLDL-C均有較好的檢測效果，但過氧化物酶法更為快速、簡便，更有助于sdLDL檢測標準化的實施，值得臨床廣泛推廣。