養血柔肝丸對多因素誘導的肝纖維化大鼠模型TGFβ1/Smad信號通路的影響

柴 焱， 張 濤， 范引科 ，惠愛武， 趙林濤， 李 芳， 張小麗

1 寶雞市中醫醫院 臨床藥學室， 陜西 寶雞 721000； 2 清華德人西安幸福制藥有限公司，西安 710043； 3 陜西省中醫藥研究院中藥研究所， 西安 710003

肝纖維化是指各種致病物質反復長期刺激肝細胞，致使細胞外基質(extracellular matrix，ECM)沉積于肝細胞的一種慢性損傷反應，是導致肝硬化、肝癌等嚴重肝臟疾病的重要因素[1]。轉化生長因子(transforming growth factor，TGF)β1對肝纖維化形成產生至關重要的影響，被認為是肝星狀細胞(HSC)激活過程中極其重要的物質。Smad蛋白是TGF將通路信號傳至細胞核內的重要下游信號因子，TGFβ1通過激活下游信號調控因子Smad2和Smad3對其促肝纖維化產生影響。研究[2]表明肝纖維化小鼠正向調控因子Smad2和Smad3表達明顯升高。Smad7則作為TGFβ1/Smad信號通路的負向調控因子，主要通過與Smad3競爭，抑制甚至中斷TGFβ1信號傳遞，從而抑制肝纖維化發生和發展，若清除Smad7基因可導致小鼠肝纖維化的發生[3]，由此可見TGFβ1/Smad信號通路的傳遞調節及相關基因表達在肝纖維化中發揮重要作用。

在中醫理論中并無“肝纖維化”這一病名辨證，常將其歸于“癥瘕積聚”的辨證范疇。陜西省中醫醫院成冬生主任醫師根據30多年的臨床經驗，發現慢性病毒性肝炎導致的肝纖維化患者多屬于淤血阻絡，肝血虛損證型，從養血柔肝、軟堅通絡的辨證思路出發，研制出了由多味中藥組成的方劑——養血柔肝丸。養血柔肝丸在預防肝纖維化發生、抑制肝纖維化進展方面療效顯著，深受患者推崇。本研究重在觀察養血柔肝丸對多因素誘導的肝纖維化大鼠TGFβ1/Smad信號通路的調節作用，深入探索養血柔肝丸治療肝纖維化的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 SPF級雄性SD大鼠50只(體質量為180～220 g)，提供單位：斯貝福(北京)生物技術有限公司，生產許可證號：SCXK(京)2019-0010，實驗動物使用許可證號：SYXK(陜)2012-006。大鼠標準飼料喂養，飲用水自由，均分籠飼養，每籠5只，光照與黑暗各12 h交替處理，濕度為50%～60%，溫度為20～22 ℃，適應性喂養1周。

1.1.2 實驗藥物和試劑 養血柔肝丸，提供單位：陜西省中醫醫院制劑中心，批號：20210403。每克藥丸相當于生藥2.376 g。組方：當歸、熟地黃、酸棗仁、五味子、雞血藤、雞內金、阿膠、鱉甲等13味藥組成。功能主治：養血柔肝，軟堅通絡。主要用于慢性病毒性肝炎肝纖維化中醫辨證屬肝血虛損，瘀血阻絡證，癥見身困乏力，口干不欲飲，頭暈目眩，四肢麻木，齒鼻衄血，納食減少或尚可，二便調，失眠多夢，舌質暗紅苔薄白或薄黃或少苔，脈細弦或脈細弦澀。用法用量：口服，1日2次，1次3～5 g。扶正化瘀膠囊(上海黃海制藥有限責任公司，批號：z20020073)；四氯化碳(天津市天力化學試劑有限公司，批號:191008);豬血清(河南巨石生物科技有限公司，生產日期：20210725)；食用酒精(紅星二鍋頭56°)(北京紅星股份有限公司)。TGFβ1抗體、Smad3抗體、Smad7抗體均由美國Abcam公司提供；總RNA提取試劑盒(CW0580 03877/05421)、逆轉錄試劑盒(CW2569 01133/50287)、定量PCR試劑盒(CW0957 01170/20210)均由康為世紀生物科技股份有限公司提供；RIPA裂解液(P0013E 111219200624)由碧云天生物技術公司提供。

1.1.3 主要設備與儀器 3-18R高速低溫離心機(江蘇恒諾儀器制造公司)；LineGene9600定量PCR儀(杭州博日科技有限公司)；Nano Drop2000超微量分光光度計(美國賽默飛公司)；DYCZ-25E型P4垂直電泳儀(北京六一生物科技有限公司)；5200multi成像儀(上海天能科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 大鼠的分組與給藥 雄性大鼠50只隨機分成空白對照組(n=6)、多因素模型組(n=9)、養血柔肝丸高劑量組(n=9)、養血柔肝丸中劑量組(n=9)、養血柔肝丸低劑量組(n=9)和扶正化瘀膠囊組(n=8)，共6組。空白對照組給予正常飲水和正常飼料，剩余各組大鼠給予改良高脂低蛋白飼料，并且第1周每日灌胃10%食用酒精，以后每日灌胃5%食用酒精。除空白對照組外，各組大鼠皮下注射含40%四氯化碳的橄欖油溶液，首次注射5 mL/kg，以后3 mL/kg，2次/周，空白對照組給予等體積橄欖油2次/周。除空白對照組外，各組大鼠腹腔注射豬血清0.5 mL/只，2次/周，空白對照組給予等體積生理鹽水2次/周，連續12周。從第7周開始，給予養血柔肝丸，分為高劑量組(9.5 g/kg)、中劑量組(4.75 g/kg)、低劑量組(2.38 g/kg)，扶正化瘀膠囊組(0.75 g/kg)，空白對照組、多因素模型組每日灌胃等量蒸餾水，連續灌胃6周，最后一次給藥后，禁食時間8 h，但不限制飲水，麻醉處理大鼠。因大鼠自身對四氯化碳不耐受等原因存在死亡情況，12周后每組大鼠各6只。

1.2.2 肝臟病理學 從各組大鼠肝臟中切取部分肝組織，置于含有4%多聚甲醛溶液中固定，固定時間24 h，再經肝組織脫水、石蠟包埋、連續切片(片厚5 μm，每個肝臟組織制作2張切片)后，一組切片用于HE染色，另一組進行Masson染色。最后經中性樹膠封片。

1.2.3 定量PCR檢測大鼠肝組織細胞中TGFβ1、Smad3、Smad7 mRNA的表達 采用Prime5.0軟件設計β-actin、TGFβ1、Smad3、Smad7基因引物序列(表1)，由西安依科生物有限公司合成。提取肝組織中RNA，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性，將其逆轉錄為cDNA，按定量PCR試劑盒要求檢測TGFβ1、Smad3、Smad7基因的mRNA表達水平。反應參數:95 ℃ 15 s(變性)、60 ℃ 40 s(退火)，循環40次，檢測基因的表達量使用2-△△ct法計算。

1.2.4 Western blot檢測大鼠肝組織細胞中TGFβ1、Smad3、Smad7蛋白的表達 使用RIPA裂解液進行肝組織蛋白提取，RIPA提前加入蛋白酶抑制劑，冰上勻漿后在4 ℃下12 000 r/min離心10 min，取上清作為蛋白樣品。按BCA試劑盒要求測定肝組織中各蛋白濃度，蛋白加熱變性后，用垂直電泳儀分離并轉膜到PVDF膜上，并使用濃度為5%脫脂牛奶封閉1.5 h，TBST搖洗膜3次，加入提前配置好的第一抗體，在4 ℃環境下孵育過夜，次日，在室溫條件下孵育1 h復溫，TBST反復洗膜3次，再加入提前配置好的第二抗體，在37 ℃環境下孵育1 h，TBST反復洗膜3次，使用成像儀進行化學發光成像操作，使用圖像分析軟件image J對曝光結果進行數據處理。

1.3 統計學方法 采用SPSS 22.0統計分析軟件進行數據處理。計量資料多組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用Dunnett-t檢驗法。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 HE染色和Masson染色觀察大鼠肝組織病理學變化 HE染色和Masson染色顯示空白對照組肝組織中未顯示任何纖維化組織增生,肝小葉結構完整、清晰可見，肝組織細胞排列整齊，未顯示細胞壞死;多因素模型組可見大量脂肪變性，肝小葉結構破壞嚴重，肝細胞排列錯亂，竇周隙清晰可見膠原纖維延伸，匯管區及匯管區周圍纖維化明顯，有假小葉形成。與多因素模型組相比，扶正化瘀膠囊組和養血柔肝丸各劑量組的纖維組織增生均有不同程度的降低。養血柔肝丸高劑量組和扶正化瘀膠囊組均可見少量脂肪變性，炎細胞浸潤局灶性，小葉間有細小纖維束形成，未形成假小葉的結構。養血柔肝丸中劑量組部分可見脂肪變性，炎細胞浸潤局灶性，未形成假小葉的結構。養血柔肝丸低劑量組可見脂肪變性，炎細胞浸潤局灶性，匯管區普遍的纖維束，已經形成纖維間隔和假小葉的結構(圖1、2)。

2.2 各組大鼠肝組織中TGFβ1、Smad3、Smad7 mRNA表達 與空白對照組相比較，多因素模型組大鼠肝組織TGFβ1、Smad3 mRNA的表達明顯升高(P值均<0.05)，而Smad7 mRNA的表達顯著降低(P<0.05);養血柔肝丸各劑量組和扶正化瘀膠囊組TGFβ1、Smad3 mRNA的表達與多因素模型組相比均有不同程度的降低(P值均<0.05)，表現出的下調作用與劑量呈正相關，以養血柔肝丸高劑量組效果最為明顯。養血柔肝丸各劑量組和扶正化瘀膠囊組Smad7 mRNA的表達與多因素模型組相比均有不同程度的升高(P值均<0.05)，表現出的上調作用與劑量呈正相關，以養血柔肝丸高劑量組作用最為顯著(圖3)。

表1 引物序列Table 1 Primer sequence

注:a，空白對照組;b，扶正化瘀膠囊組;c，多因素模型組;d，養血柔肝丸低劑量組;e，養血柔肝丸中劑量組;f，養血柔肝丸高劑量組；箭頭指示病變。圖1 各組大鼠肝組織細胞HE染色(×100)Figure 1 HE staining of liver tissues of rats in each group(×100)

注: a，空白對照組;b，扶正化瘀膠囊組;c，多因素模型組;d，養血柔肝丸低劑量組;e，養血柔肝丸中劑量組;f，養血柔肝丸高劑量組；箭頭指示病變。

注: a，空白對照組;b，扶正化瘀膠囊組;c，多因素模型組;d，養血柔肝丸低劑量組;e，養血柔肝丸中劑量組;f，養血柔肝丸高劑量組。

2.3 各組大鼠肝組織細胞中TGFβ1、Smad3、Smad7蛋白的表達 與空白對照組相比較，多因素模型組大鼠肝組織中TGFβ1蛋白的表達明顯增加(P<0.05)；與多因素模型組比較，養血柔肝丸各劑量組和扶正化瘀膠囊組大鼠肝組織中TGFβ1蛋白的表達量減少(P<0.05)。與空白對照組相比較，多因素模型組大鼠肝組織中Smad3蛋白的表達明顯增加而Smad7蛋白的表達明顯減少(P值均<0.05);養血柔肝丸高、中劑量組與扶正化瘀膠囊組大鼠肝組織中Smad3蛋白的表達較多因素模型組降低(P值均<0.05)；養血柔肝丸各劑量組與扶正化瘀膠囊組大鼠肝組織中Smad7蛋白的表達較多因素模型組顯著升高(P值均<0.05)，以養血柔肝丸高劑量組作用最為明顯(圖4、5)。

注: a，空白對照組;b，扶正化瘀膠囊組;c，多因素模型組;d，養血柔肝丸低劑量組;e，養血柔肝丸中劑量組;f，養血柔肝丸高劑量組。圖4 Western blot檢測各組大鼠肝組織TGFβ1、Smad3、Smad7表達結果Figure 4 Expression of TGFβ1，Smad 3 and Smad 7 in liver tissues detected by Western blot

3 討論

當肝細胞受到藥物、酒精、病毒等長期刺激時，肝細胞會發生自我修復反應，進而發生纖維化，肝纖維化是發展為慢性肝病甚至肝硬化的必經階段，但是在此階段尚有逆轉的可能，若進入肝硬化階段則難以逆轉[4]。肝纖維化的發生是多種細胞因子通過多條信號通路共同作用的復雜病理發展過程，其中HSC的活化被認為是肝纖維化發生的重要一環[5]，肝臟受到損傷或受到炎癥細胞因子的作用，誘導產生ECM，最終導致肝纖維化[6]。

HSC從活化、增殖再到轉化為成纖維母細胞，期間產生大量ECM，是發生纖維化的核心機制。目前研究[7-8]發現，TGFβ1是導致肝纖維化最為關鍵的細胞因子之一。TGFβ1通過激活Smad通路參與肝干細胞促進肝纖維化的過程[9]。在肝纖維化TGFβ1/Smad通路相關研究中，研究較清楚明確的有TGFβ1/Smad2、TGFβ1/Smad3、TGFβ1/Smad4、TGFβ1/Smad7。Smad4基因和Smad7基因反向作用調節TGFβ1信號傳導，通過與Smad2基因和Smad3基因競爭性的結合TGFβRⅠ，導致TGFβ1信號傳導被阻斷，抑制肝纖維化的發展。相關研究[10]顯示，Smad3基因是導致小鼠肝纖維化的相關因子，若將該基因移除，可使膠原蛋白表達量顯著下降，Smad7基因負向調節表達量則呈顯著增長。若將Smad7基因移除，大鼠的HSC數目增多，ECM大量蓄積。Smad7蛋白表達量的增加可以抑制HSC增殖及Ⅰ型膠原的產生，抑制肝纖維化的蔓延[11]。本次實驗結果顯示，養血柔肝丸能顯著降低肝纖維化大鼠肝TGFβ1及Smad3基因的表達，上調Smad7基因的表達，證明TGFβ1/Smad信號通路是養血柔肝丸治療肝纖維化的作用機制之一。

綜上所述，養血柔肝丸具有顯著的抗肝纖維化療效，其機制可能是養血柔肝丸抑制TGFβ1、Smad3基因的表達，上調Smad7基因的表達，抑制TGFβ1/Smad信號通路激活，減少HSC的產生。這為治療肝纖維化提供了實驗基礎，為臨床進一步使用養血柔肝丸改善肝纖維化、保護肝臟功能提供了更多理論依據。

倫理學聲明：本研究方案于2020年6月19日經由陜西省中醫藥研究院倫理委員會審批，批號：(2020)倫審意見第(512)號，符合實驗室動物管理與使用準則。

利益沖突聲明：本研究不存在研究者、倫理委員會成員以及與公開研究成果有關的利益沖突。

注:a，空白對照組;b，扶正化瘀膠囊組;c，多因素模型組;d，養血柔肝丸低劑量組;e，養血柔肝丸中劑量組;f，養血柔肝丸高劑量組。圖5 各組大鼠肝組織細胞TGFβ1、Smad3、Smad7蛋白表達水平Figure 5 Expression of TGFβ1，Smad 3 and Smad 7 proteins in liver tissues of the rats in each group

作者貢獻聲明：柴焱負責數據整理，撰寫論文；張濤、范引科、惠愛武、趙林濤、李芳負責實驗操作，數據分析，病理分析，并指導修改文章；張小麗負責課題設計，擬定寫作思路，指導撰寫文章并最后定稿。