急性胰腺炎患者血漿內皮細胞微粒水平的改變及其形成機制

王迪迪， 劉秋圓， 胡 翠， 王兵兵， 韋亞蓉， 丁 浩， 劉曉昌， 梅 俏

安徽醫科大學第一附屬醫院 消化內科， 合肥 230022

急性胰腺炎(acute pancreatitis,AP)是消化內科常見的急腹癥，約20%的患者可發展為重癥急性胰腺炎(severe acute pancreatitis，SAP)，引起嚴重的全身炎癥反應綜合征，SAP病死率高達30%，但其發病機制尚未完全闡明[1-2]。大量研究將AP的發病機制歸因于胰酶激活和胰腺自身消化，繼發免疫介導損傷和胰腺微循環障礙[3]。研究[4]表明，血管內皮細胞功能損傷可能是AP微循環障礙的核心機制之一。近年來，高脂血癥導致的AP發病率逐年增加，其中三酰甘油代謝產生的游離脂肪酸和乳糜微粒引起胰腺毛細血管阻塞并誘發胰腺微循環障礙，游離脂肪酸通過刺激炎癥介質合成，抑制線粒體功能，損傷胰腺血管內皮細胞和腺泡細胞，導致胰腺炎的發生[5]。因此，內皮細胞功能改變在AP發病過程中具有重要作用。

內皮細胞微粒(endothelial microparticles，EMP)是內皮細胞受到各種刺激時釋放直徑為0.1～1 μm的微囊泡，內含大量mRNA、microRNA、脂質和蛋白質等，作為細胞間轉移炎癥信號物質的載體，是近年來內皮細胞功能研究的熱點[6]。研究[7-10]表明系統性紅斑狼瘡、慢性腎臟病、急性冠狀動脈綜合征、糖尿病等患者中EMP水平均明顯升高，同時EMP通過加重機體的血管內皮細胞損傷，促進組織炎癥反應過程。但是在胰腺炎的發病過程中機體EMP的水平變化尚不清楚。因此，本研究通過檢測不同嚴重程度AP患者血漿中EMP水平，以及通過體外實驗觀察AP患者血漿刺激EMP形成的初步機制，探討EMP在AP患者發病機制中的可能作用。

1 資料與方法

1.1 研究對象 收集本院2020年8月—2021年6月60例AP住院患者的血液標本，分為輕癥急性胰腺炎(mild acute pancreatitis，MAP)組(n=23)、中度重癥急性胰腺炎(moderately severe acute pancreatitis，MSAP)組(n=23)和重癥急性胰腺炎(SAP)組(n=14)。AP診斷標準參考2012亞特蘭大分類新標準共識[11]，并選取20例健康體檢者作為對照組。

1.2 材料與儀器 人臍靜脈血管內皮細胞(human umbilical vein endothelial cells, HUVEC)購自美國ScienCell公司；BI血清購自以色列生物科技公司; PBS、RPMI-1640培養基購自美國 Hyclone公司; 青霉素-鏈霉素混合液、0.25% 胰蛋白酶購自北京索萊寶生物科技有限公司;LPS購自美國sigma公司(B5-L2880)；內皮素(endothelin 1，ET-1)、血管性血友病因子(von willebrand factor，vWF)、一氧化氮(nitric oxide,NO)、血管內皮細胞黏附分子1(VCAM-1)ELISA 試劑盒均購自武漢新啟迪生物科技有限公司;CCK-8試劑盒購自biosharp公司；RT-PCR 反轉錄試劑盒、熒光定量PCR試劑盒購自日本 Takara 公司;GAPDH引物、內皮型一氧化氮合酶(eNOS)、誘導型一氧化氮合酶(iNOS)、細胞間黏附分子-1(ICAM-1)、VCAM-1、NADPH氧化酶及P-選擇素引物由上海生工生物工程股份有限公司設計與合成;ABI QuantStudio6 Flex qRT-PCR 儀(賽默飛世爾科技有限公司)。Transwell inserts(型號3413，美國康寧公司); CD31 APC、CD41PE(美國eBioscience 公司);Flow-Count Fluorspheres(美國Beckman公司);CytoFLEX 分析流式細胞儀(美國Beckman Coulter公司);多功能酶標儀(美國PE公司)。

1.3 研究方法

1.3.1 EMP分離 收集患者入院后(24 h內)次日晨血5 mL于檸檬酸鈉抗凝管中，采用差速離心法，以1500 r/min離心10 min獲取富血小板血漿，再以4000 r/min離心30 min，獲取貧血小板血漿(PPP)，于-80 ℃保存[6]。

1.3.2 EMP檢測 將PPP解凍，取50 μL PPP，加入5 μL CD31-APC、5 μL CD41-PE充分混合，室溫下避光孵育30 min，再加入400 μL Bindbuffer、40 μL Flow-CountTM熒光計數微球充分混合，采用流式細胞儀檢測 EMP，使用5 μL兔抗人PE-IgG1及5 μL PE-IgG1作為對照。CD31-APC陽性及CD41-PE陰性為 EMP，根據熒光計數微球計算 EMP 水平。

1.3.3 內皮細胞功能相關因子檢測 AP患者血漿中ET-1、vWF、NO、VCAM-1水平，按照ELISA試劑盒說明書進行檢測。

1.3.4 HUVEC細胞培養和實驗分組 HUVEC細胞復蘇，培養于37 ℃、5% CO2的細胞培養箱中，使用 10% BI血清、1% 青霉素-鏈霉素溶液進行培養，根據細胞生長狀況2～3 d更換1次培養基，顯微鏡下觀察細胞匯合程度達到 80% 時，用0.25% 的胰蛋白酶消化細胞，重懸細胞并計數，以5×104個/孔的密度接種于24孔(0.4 μm)的 Transwell inserts中。將接種于Transwell inserts中的HUVEC細胞，培養24 h，饑餓處理12 h后，另各取MAP、MSAP、SAP患者的PPP，采用超速離心法(100 000×g)4 ℃離心2 h以去除AP患者血漿中的EMP[12]，取上清，分別加入到Transwell的下室，與上室的HUVEC共培養6 h，10 μg/mL的LPS作為陽性對照組，CCK-8法檢測HUVEC細胞活力。

1.3.5 HUVEC上清液中EMP檢測 收集Transwell inserts中上室的細胞培養液，再以4000 r/min離心30 min，流式細胞儀檢測方法同AP患者血漿中EMP的檢測。

1.3.6 HUVEC中eNOS、iNOS、ICAM-1、VCAM-1、NADPH氧化酶及P-選擇素的mRNA表達水平 用Trizol提取Transwell inserts中HUVEC細胞的總RNA，用Takara公司的逆轉錄試劑盒將RNA逆轉錄為 cDNA，采用 QuantiNova SYBR Green PCR 試劑盒進行定量 PCR 反應，反應條件為 95 ℃、2 min 1個循環; 95 ℃、5 s，60 ℃、15 s，72 ℃、20 s 共 40 個循環。所用qRT-PCR引物序列見表1。用 2-ΔΔCt方法計算eNOS、iNOS、ICAM-1、VCAM -1、NADPH氧化酶及P-選擇素的mRNA的相對表達量。

1.3.7 DCFH-DA法檢測HUVEC中的細胞活性氧(ROS)含量 收集Transwell inserts中HUVEC，500×g離心5 min,加入1 mL無血清培養液稀釋的終濃度為10 μmol/L的DCFH-DA，37 ℃孵育20 min；用無血清培養液洗滌細胞3次，500×g離心5 min,重懸于400 μL無血清培養液，立即采用流式細胞儀檢測。

1.3.8 JC-1染色法檢測HUVEC的線粒體膜電位 收集Transwell inserts中HUVEC，PBS洗滌細胞，500×g離心5 min,分別加入1 mL 細胞培養液和1 mL JC-1染色工作液，混勻，37 ℃孵育20 min；用JC-1染色緩沖液(1×)洗滌2次，500×g離心5 min,重懸于400 μL細胞培養液，立即采用流式細胞儀檢測。

表1 qRT-PCR引物序列Table 1 Primers of qRT-PCR

2 結果

2.1 一般資料 60例AP患者中膽源性28例，高脂血癥型20例，混合型3例，酒精性1例，其他8例。各組WBC、中性粒細胞、CRP、Alb、ALT、AST、ALP、LDH、BUN、CRE、鉀、鈉、鈣、血糖水平比較差異均有統計學意義(P值均<0.05)；與MAP組比較，MSAP和SAP組的APACHEⅡ評分、BISAP評分、Ranson評分、CT評分均有統計學差異(P值均<0.05)(表2)。

2.2 AP患者血漿中EMP水平的檢測 與對照組相比[(188.09±17.20)個/μL]，MAP組[(369.41±156.78)個/μL]、MSAP組[(997.29±186.24) 個/μL]、SAP組[(1 769.00±274.62)個/μL]EMP水平明顯升高(P值均<0.05)。與MAP組、MSAP組比較，SAP組EMP水平明顯升高(P值均<0.05)(圖1)。

2.3 不同嚴重程度的AP患者血漿中EMP水平與臨床特征的關聯分析 AP患者EMP水平與APACHEⅡ、BISAP評分、Ranson評分、CT評分、CRP均呈正相關(r值分別為0.686 2、0.777 3、0.713 8、0.771 8、0.473 9，P值均<0.01)。

表2 AP患者臨床資料Table 2 Clinical data of acute pancreatitis patients

2.4 AP患者血漿中ET-1、vWF、NO、VCAM-1水平的檢測 與對照組相比，MAP組、MSAP組、SAP組的ET-1、vWF、VCAM-1水平明顯升高，NO水平明顯降低(P值均<0.05)(圖2)。

2.5 AP患者血漿對HUVEC中EMP合成水平的影響 與對照組相比，MAP組患者血漿對HUVEC中EMP水平影響不大(P>0.05)，MSAP和SAP組血漿可促進HUVEC中EMP大量釋放(P值均<0.05)，提示AP患者血漿中含有致內皮細胞損傷炎性介質，加重HUVEC損傷和EMP生成(圖3)。

2.6 AP患者血漿對HUVEC中eNOS、iNOS、ICAM-1、P-選擇素、VCAM -1、NADPH氧化酶的mRNA表達水平的影響 用10 μg/mL的LPS作陽性對照，分別用正常人的血漿和不同嚴重程度AP患者的血漿刺激HUVEC 6 h，CCK-8檢測提示HUVEC活力為76.90%。eNOS、iNOS、ICAM-1、VCAM -1、NADPH氧化酶及P-選擇素的mRNA表達水平均增加，與對照組比較，除MAP組的VCAM-1和eNOS外，其余各組的eNOS、iNOS、ICAM-1、P-選擇素、VCAM -1、NADPH氧化酶的mRNA表達水平均顯著升高(P值均<0.05)(圖4)。

注：P1，EMP所在區域；P2，藻紅蛋白(PE)和別藻藍蛋白(APC)雙陽性區域；P3，陰性顆粒所在區域；P4，藻紅蛋白(PE)陽性區域。圖1 不同嚴重程度AP患者的EMP水平檢測Figure 1 EMP level of AP patients with different severity

圖2 AP患者血漿中ET-1、vWF、NO、VCAM-1水平改變

2.7 AP患者血漿對HUVEC中ROS水平的影響 與對照組ROS水平(4.57%±0.19%)相比，MAP組(5.70%±0.38%)、MSAP組(7.40%±0.10%)、SAP組(12.95%±0.26%)、LPS組(63.00%±0.55%)患者HUVEC中的ROS水平均升高明顯(P值均<0.05)。

2.8 AP患者血漿對HUVEC中線粒體膜電位的影響 與對照組線粒體膜電位下降率(0.54%±0.39%)相比，MAP組(2.24%±0.30%)、MSAP組(7.48%±2.49%)、SAP組(12.90%±1.61%)、LPS組(63.17%±1.65%)HUVEC中的線粒體膜電位下降更明顯(P值均<0.05)。

3 討論

AP發生過程中，胰腺微血管在組胺、白三烯、緩激肽等炎癥介質的作用下促進血管內皮細胞收縮,同時IL-1β、IL-6、IL-18、TNFα等細胞因子通過內皮細胞骨架的重構，導致血管內皮通透性增加，胰腺微循環血管屏障受到破壞[13]。另一方面血管內皮細胞活化或受到刺激時EMP釋放增加。EMP是一種內皮功能障礙的血漿標志物，由內皮細胞在激活、損傷或凋亡時釋放，可將大量的生物活性分子，如生長因子、蛋白酶、黏附分子、DNA和microRNA轉移到受體細胞，加重炎癥損傷[14]。因此胰腺微血管內皮細胞結構及功能受損是AP過程中的重要發病機制。

EMP水平升高是炎癥性疾病的臨床特征，Parker等[7]研究表明系統性紅斑狼瘡(SLE)與內皮細胞損傷和功能障礙有關，活動性SLE患者EMP水平明顯升高，降低EMP水平有助于改善SLE患者的心血管風險,改善炎癥疾病活動度同時可改善EMP水平，表明抑制炎癥是影響EMP變化的關鍵因素。Pernomian等[15]研究表明糖尿病患者高血糖通過氧化應激反應，促使EMP釋放增加，誘導促炎途徑并發心血管功能障礙，導致心血管事件的發生，表明EMP在糖尿病疾病發展過程中起到關鍵作用。本研究采用CD31、CD41檢測EMP[定義CD31(+)CD41(-)為EMP]，結果發現，AP患者EMP水平升高，且SAP組患者的EMP水平明顯高于MAP組和MSAP組，EMP水平與疾病的嚴重程度呈正相關，表明EMP可作為評估AP炎癥程度的生物學指標。

注：Q2-UL,EMP所在區域；Q2-UR,藻紅蛋白(PE)和別藻藍蛋白(APC)雙陽性區域； Q2-LL,陰性顆粒所在區域； Q2-LR,藻紅蛋白(PE)陽性區域。

圖4 AP患者血漿對HUVEC中eNOS、iNOS、ICAM-1、VCAM -1、NADPH氧化酶及P-選擇素 mRNA表達的影響

內皮細胞損傷和功能障礙在炎癥反應中的作用逐漸被認識，是近年來內皮細胞功能研究的熱點[14]。TNFα作為炎癥反應過程中最早出現的炎癥因子，可激活中性粒細胞釋放彈性蛋白酶，增加血管內皮細胞的通透性[16]。內皮細胞以TLR4依賴的方式響應LPS，導致隨后促炎細胞因子的釋放和黏附分子的表達增強，進一步刺激炎癥級聯反應[17]。因此，在AP的病理生理過程中，以TNFα為主要代表的炎癥細胞因子和LPS等均具有損傷血管內皮細胞的作用。在AP的發病過程中，研究表明炎癥反應與內皮損傷之間存在一定的相互作用關系，且同時伴隨著EMP水平的改變。本研究發現與健康對照組相比，MAP組、MSAP組、SAP組的內皮細胞功能標志物ET-1、vWF、VCAM-1水平明顯升高，表明AP中存在內皮細胞損傷及功能障礙，同時與EMP水平改變呈現同步趨勢。

氧化損傷機制在EMP的形成中具有重要作用。線粒體功能障礙在誘導ROS合成和內皮功能障礙等方面起促進作用。研究[18]表明,高葡萄糖刺激可以增加EMP的形成，ROS水平增加，促氧化活性提高，EMP形成又可導致糖尿病患者更嚴重的血管功能障礙。有研究[3,19]表明在L-精氨酸誘導的SAP實驗模型中血管內皮細胞受損，細胞內儲存的Ca2+瞬間釋放，Ca2+與鈣調蛋白結合激活一氧化氮合酶，一氧化氮合酶和NADPH氧化酶是細胞內產生ROS的主要來源，引起氧化應激，降低線粒體膜電位，引起內皮細胞氧化損傷和促進內皮功能障礙。鐵超載可引起內皮細胞ROS和Ca2+內流增加，線粒體功能損傷，膜電位喪失，導致EMP水平顯著增加[20]。糖尿病患者通過增強腎素-血管緊張素系統，引起血管氧化應激和NADPH氧化酶活性，產生的ROS激活EMP生成[15]。Chen等[21]研究表明糖尿病患者晚期糖基化終末產物(AGE)加速形成，AGE通過NADPH氧化酶激活ROS途徑釋放EMP。上述研究表明，ROS增加和線粒體功能障礙是EMP形成的重要機制之一。因此，在體外實驗中，使用含有炎癥介質的AP患者的血漿刺激HUVEC，結果發現EMP水平明顯升高，eNOS、iNOS、ICAM-1、VCAM -1、NADPH氧化酶及P-選擇素的mRNA表達增加，細胞中ROS的水平升高，線粒體膜電位下降明顯，從細胞水平證明AP患者血漿中含有致內皮損傷炎性介質，通過ROS增加和線粒體功能障礙，加重內皮細胞損傷和EMP形成，是AP發病機制的重要環節。

綜上所述，AP發病過程中炎癥介質通過氧化機制和線粒體功能障礙損傷血管內皮細胞，形成大量 EMP并與AP嚴重程度相關，表明 EMP可作為 AP 疾病嚴重程度評估的指標。但EMP在AP發病過程中的具體作用機制和EMP形成的精確機制尚不明確，均需要進一步的臨床和基礎研究加以探討。

倫理學聲明：本研究于2019年10月15日經安徽醫科大學第一附屬醫院倫理委員會批準，批號：PJ2018-12-17，所有研究對象均簽署知情同意書。

利益沖突聲明：本研究不存在研究者、倫理委員會成員、受試者監護人以及與公開研究成果有關的利益沖突。

作者貢獻聲明：王迪迪、劉秋圓負責課題設計，資料分析，撰寫論文；胡翠、王兵兵、韋亞蓉、丁浩參與收集數據，修改論文；劉曉昌、梅俏負責擬定寫作思路，指導撰寫文章并最后定稿。