谷子NPR1基因特征及響應禾生指梗霉侵染的表達分析

劉旭，張諾，徐林，孫卓楠，張寶俊

（山西農業大學 植物保護學院，山西 太谷 030801）

植物與病原菌在長期進化的過程中，形成了高效的免疫防御系統。由病原菌保守相關分子模式觸發的免疫反應（PAMPs-Triggered Immunity，PTI）和效應子觸發的免疫反應（Effector-Triggered Immunity，ETI）在寄主抵御外來病原菌侵染中發揮重要作用。由水楊酸（Salicylic acid，SA）的產生及積累誘發的植物系統獲得性抗性（Systemic acquire resistance，SAR）也是寄主受病菌侵染后激活防衛反應的重要組成部分，并伴隨病程相關蛋白（Pathogenesis-related proteins，PRs）的表達[1]。病程相關基因1的非表達子（NPR1）是水楊酸信號通路中核心調控元件，是植物病程相關蛋白基因表達及SAR的激活子[2]。當病菌侵入寄主植物后，NPR1寡聚體在水楊酸的積累下，被氧化還原為單體，并與轉錄因子TGA互作，從而誘導PR基因的表達[3]。

NPR1基因主 要包含2個 結 構域：BTB/POZ和Ankyrin-Repeat結構域，且與蛋白間的互作緊密相關[4-5]。研究人員首先在擬南芥中鑒定到6個NPR1基因[6-9]，CAO等[7]研 究 發 現，AtNPR1通過啟動 子區W-box序列與轉錄因子WRKY相結合，激活下游PR基因的表達，誘導寄主獲得系統抗病性，此外，AtNPR5、AtNPR6還被證實參與調控葉片及花器官的生長發育[8-9]。隨著生物信息學及測序技術的發展，NPR1基因相繼在多種作物中被鑒定，主要在植物抗病性方面發揮重要作用。SILVA等[10]在二倍體草莓中過表達擬南芥AtNPR1，發現AtNPR1通過誘導防御基因FvPR1和FvPR5轉錄本的積累，增強草莓對白粉病、角斑病及炭疽病的抗性；YUAN等[11]在水稻中過表達OsNPR1，顯著增強水稻對白葉枯病的抗性以及草食性生物對水稻的敏感性；WANG等[12]在本氏煙和油菜中過表達BnaNPR1，激活了與SA防御反應相關基因的表達，而抑制了與JA信號相關基因的表達，增強其對核盤菌的抗性。可見，NPR1基因在植物響應病菌侵染的過程中，通過激活相關抗病基因及SAR信號途徑來抵御病原菌侵染。

谷子白發病是由禾生指梗霉（Sclerospora graminicola）引起的一種系統性侵染卵菌病害，嚴重影響著谷子的產量。禾生指梗霉是一種典型的活體營養型病菌，研究禾生指梗霉侵染過程中SA的響應及積累對谷子抗白發病機制的研究具有重要意義，而有關谷子SiNPR1家族基因的研究鮮有報道。

為了挖掘谷子中NPR1基因的相關功能，本研究通過生物信息學方法篩選及鑒定谷子全基因組中的NPR1家族基因，對其進行基因定位、蛋白特性分析、進化分析、motif分析、啟動子順式作用元件分析，并分析了谷子在響應禾生指梗霉侵染條件下NPR1基因的表達模式，深入解析NPR1家族基因在谷子生長發育及抗病代謝通路中發揮的作用，旨在為谷子抗病育種奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 谷子NPR1家族基因的獲取及基因鑒定

從Multi-omics Database forSetaria italica數據庫(http://foxtail-millet.biocloud.net/home)中獲取xiaomi基因組序列，以從國家水稻數據中心（https://www.ricedata.cn/）下載 到 的5條水稻NPR1蛋白序列及TAIR數據庫（https://www.arabidopsis.org/）獲取的6條擬南芥NPR1蛋白序列作為搜索谷子同源基因的探針序列。在TBtools工具中利用BLAST GUI Wrapper程序，在谷子全基因組蛋白序列中搜索同源序列。選取比對值Evalue＜0.01。

1.2 基因定位及蛋白特性分析

利用ExPASY-ProtParam在線工具(https://web.expasy.org/protparam/)預測谷子NPR1家族蛋白的理化性質，包括基因組位置、氨基酸數目、分子量、等電點、親水性均值；利用PSORT Prediction在線工具（http://psort1.hgc.jp/form.html）進行亞細胞定位預測分析。

1.3 谷子NPR1家族基因系統發育樹構建

使用MEGA 7.0對篩選的擬南芥、水稻和谷子的NPR1家族蛋白序列進行序列比對，采用鄰接法（Neighbor Joining Algorithm）構建系統發育樹，其中BootStrap參數設置為1 000，其他參數選擇默認。借助在線工具iTOL（https://itol.embl.de/）進一步優化進化樹。

1.4 谷子NPR1家族基因motif、基因結構、順式作用元件預測分析

從谷子基因組gff3文件中篩選出NPR1基因結構信息，利用MEME網站（http://meme-suite.org/tools/meme）對谷子NPR1蛋白進行保守結構域預測，并在TBtools中可視化。在Pfam（http://pfam.xfam.org/）數據庫進行保守結構域分析。將谷子NPR1家族基因的啟動子序列在Plantcare（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）網站進行在線順式作用元件分析，預測該家族基因可能存在的功能。

1.5 谷子NPR1基因表達差異分析

從Multi-omics Database forSetaria italica數據庫(http://foxtail-millet.biocloud.net/home)中獲得谷子種子、根、莖、穗、葉不同組織的基因表達量數據。基于各基因在植物組織各器官的表達差異構建表達熱圖，并利用可視化軟件TBtools展示。

依據實驗室前期轉錄組數據，以晉谷20為植物材料，將上一年從病殘體中收集的卵孢子與種子按1∶15的比例進行拌種，種植于山西農業大學雜糧試驗基地，以甲霜靈拌種作為對照（甲霜靈∶種子=1∶500）。在營養生長期、生長錐伸長期、枝梗分化期、小穗和剛毛分化期、雌雄蕊分化期（時期記為T1、T2、T3、T4、T5）取葉片及幼穗，對照健康葉片組記為Leaf_CK1-Leaf_CK5，處理組記為Leaf_TG1-Leaf_TG5；對照健康幼穗組記為Panicle_CK1-Panicle_CK5，處理組記為Panicle_TG1-Panicle_TG5，分析谷子NPR1基因在禾生指梗霉侵染下不同時期的表達情況，利用RStudio對各組FPKM值進行pheatmap圖繪制。

2 結果與分析

2.1 谷子NPR1基因篩選、基因定位和蛋白特性分析

利用BLASTP在xiaomi基因組中鑒定到4個NPR1基 因，命 名 為SiNPR1～SiNPR4，均 包 含BTB/POZ和Ank結構域（圖1-A）。利用TBtools對谷子NPR1基因進行染色體定位，SiNPR1～SiNPR4基因分布在5、8、9號染色體上（圖1-B）。

圖1 谷子NPR1基因結構域及基因定位Fig.1 NPR1 gene domain and gene location in foxtail millet

理化性質分析表明，谷子NPR1家族基因氨基酸數目分布在475～629個，平均數目為569個；蛋白分子質量介于50.29～68.96 ku；等電點位于5.52～6.11；除SiNPR3表現為疏水性外，其他均表現為親水蛋白；亞細胞定位預測顯示，SiNPR1定位于細胞核中，SiNPR3定位于質膜，SiNPR2和SiNPR4均定位于葉綠體中（表1）。

表1 谷子NPR1基因理化性質分析Tab.1 Analysis of physicochemical properties of NPR1 genes in foxtail millet

2.2 谷子NPR1家族成員系統進化分析

谷子NPR1家族基因系統進化分析結果如圖2所示。

圖2 谷子NPR1家族基因系統進化分析Fig.2 Phylogenetic analysis of NPR1 family genes in foxtail millet

谷子NPR1家族基因系統進化樹共分為3類（圖2），其中Class1中SiNPR2與OsNPR2的親緣關系最近，SiNPR4與OsNPR3的親緣關系最近，但均與AtNPR3和AtNPR4同源；Class2表明，SiNPR1與OsNPR1的同源關系最近，且與AtNPR1和AtNPR2同源；Class3中SiNPR3與OsNPR5、AtNPR5、AtNPR6、OsNPR4同源，其 中AtNPR5和AtNPR6的同源關系最近。

2.3 谷子NPR1家族基因保守結構域及基因結構分析

對谷子NPR1家族基因進行保守結構域和基因結構分析發現，谷子NPR1家族基因中含有8個基序（motif1～motif8），長度分布在24～50個氨基酸（表2），其中SiNPR1、SiNPR2、SiNPR4均包含8個motif基序，且基序排列順序均為motif6、motif2、motif7、motif3、motif4、motif5、motif1、motif8。SiNPR3僅含有5個保守基序，不包含motif1、motif5、motif8（圖3-A）。基因結構分析表明，所有家族成員在上下游均含有調控區（UTR）、外顯子，但其具體的位置和長度存在差異（圖3-B）。

表2 谷子NPR1家族基因蛋白基序信息Tab.2 Protein sequence information of NPR1 family genes in foxtail millet

圖3 谷子NPR1家族基因保守基序分析Fig.3 Conservative motif analysis of NPR1 family genes in foxtail millet

2.4 谷子NPR1家族基因順式作用元件

順式作用元件分析結果顯示，SiNPR1～SiNPR4基因包含的元件分別有16、27、18、41個（圖4），均包含脫落酸反應元件（abscisic acid responsive element）、防御和壓力反應元件（defense and stress responsive element）和光響應元件（light responsive element）。其 中，僅SiNPR1和SiNPR4含 有 水 楊酸反應元件（salicylic acid responsive element），推測其可能通過調控水楊酸生物合成來調控谷子對病菌侵染的響應；SiNPR3和SiNPR4均含有赤霉素反應元件（gibberellin responsive element）、生長素響應元件（auxin responsive element）、茉莉酸甲酯響應元件（MeJA responsive element）及低溫響應元件（low temperature responsive element），推測其可能參與調控谷子的生長發育。

圖4 谷子NPR1家族基因順式作用元件分析Fig.4 Analysis of cis-acting elements of NPR1 family genes in foxtail millet

2.5 谷子NPR1家族基因表達差異分析

谷子NPR1家族基因組織特異性表達結果表明，NPR1家族基因在谷子不同部位的FPKM值分布在0～82.2，且在不同組織中均存在表達特異性（圖5）。

圖5 NPR1家族基因表達熱圖Fig.5 Gene expression heat map of NPR1 family genes

圖5-A從左到右依次為灌漿期旗葉（Flag leaf filling stage）；旗葉鞘充盈期（Flag leaf sheath filling stage）；葉肉S3時期（Mesophyll S3）；根填充階段（Root filling stage）；抽穗后2 d的旗葉（Leaf top 2 days after heading）；葉脈S3時期（Leaf veins S3）；灌漿期旗葉（Leaf top filling stage）；頸穗節間充盈期（Neck panicle internodes filling stage）；灌漿期葉鞘（Leaf sheath top filling stage）；莖頂第2填充階段（Stem top second filling stage）；3 d發 芽 的 種 子（Germinated seeds 3 d）；一尖兩葉期（Plant one tip two leaf）；未成熟種子S5時期（Immature seed S5）；初生穗分枝分化階段（Primary panicle branch differentiation stage）；穗部第3穗分枝分化期（Panicle third panicle branch differentiation stage）；未成熟小穗S4時期（Immature spikelet S4）；未成熟種子S4時期（Immature seed S4）；未成熟種子S2時 期（Immature seed S2）；未 成 熟 種 子S1時 期（Immature seed S1）；未成熟種子S3時期（Immature seed S3）；未成熟小穗S2時期（Immature spikelet S2）。由圖5可知，SiNPR2在旗葉的不同時期及其他葉肉細胞中特異高表達，其中旗葉鞘充盈期FPKM值高達82.2，其次是灌漿期旗葉和頸穗節間充盈期，而在種子和谷穗中低表達或不表達；SiNPR1在未成熟種子S1時期表達量最高，為59.58，而在穗部各時期均不表達；SiNPR3和SiNPR4均在灌漿期旗葉中高表達，而在未成熟種子的各時期低表達或不表達。表明NPR1家族基因在不同組織中存在不同的表達特性，預示其在谷子的生長發育及抗逆反應中的復雜功能。對NPR1家族基因在不同時期組織進行聚類分析，發現不同時期種子聚為一類，不同時期葉片聚為一類，表明NPR1家族基因在特定組織的不同時期的表達具有穩定性。

轉錄組分析結果表明，在禾生指梗霉脅迫下，SiNPR1、SiNPR3、SiNPR4在葉片中呈上調趨勢，SiNPR2表達量下調（圖5-B），其中，SiNPR1在T3、T4、T5時期明顯上調，以T4時期差異最為顯著，該時期是禾生指梗霉病菌有性態卵孢子形成關鍵期，會導致谷子葉肉細胞破壞，葉片發生縱裂。SiNPR1、SiNPR2、SiNPR4在穗部轉錄組中也表現出上調表達趨勢，其中，SiNPR1在T5時期差異最為顯著，此時是病菌侵染穗部的關鍵時期。

3 結論與討論

SA是植物體內的小分子酚類物質，參與活體或半活體營養型病原菌引發的ETI免疫反應并誘發植物的系統獲得抗性。NPR1是水楊酸信號通路中一類關鍵因子，作為SA的受體能與SA分子結合，激活TGAs等轉錄因子的活性，啟動PR等抗病基因的表達，從而誘導產生SAR。NPR1賦予小麥、蘋果、煙草等作物抗性的研究相繼報道[13-15]。研究表明，在芥菜、柑橘中過表達NPR1基因可提高寄主對病原菌的抗性[16-17]。此外，NPR1家族基因在植物非生物脅迫方面也發揮作用，如AtNPR1與HSFA1相互作用，提高擬南芥的抗寒性[18]。

本研究在谷子中共鑒定到4個NPR1家族基因，理化性質分析表明，谷子NPR1家族基因氨基酸數目分布在475～629個，蛋白分子質量介于50.29～68.96 ku，等電點位于5.52～6.11，與香蕉、油桐中報道的較為相似[19-20]。谷子NPR1家族基因分布在5、8、9號染色體上，且均包含BTB/POZ和Ankyrin結構域，為與TGA蛋白互作提供了條件[21]。motif分析中共鑒定到8個motif基序，除SiNPR3以外，其他家族基因基序排列順序一致，推測其可能與遺傳進化中的變異有關；基因結構分析發現，所有家族成員在上下游均含有調控區（UTR）、內含子、外顯子。谷子NPR1家族基因在各個組織部位均有表達，但不同組織間的表達存在差異，與大白菜NPR1家族基因的組織表達模式相似[22]。

YUAN等[11]研究發現，過表達OsNPR1被證實可提高水稻對白葉枯病的抗性；JIANG等[23]研究發現，OsNPR3與TGAL11互作能提高水稻對白葉枯病的抗性；HEPWORTH等[9]研究表明，AtNPR5、AtNPR6參與調控擬南芥葉片和花器官的發育。進化分析表明，SiNPR1、SiNPR4分別與OsNPR1、OsNPR3同源，SiNPR2與OsNPR2同源，結合轉錄組結果分析發現，受侵染葉片的SiNPR1在T3、T4、T5時期的表達顯著上調，分別是對照的6.57倍、10.25倍、9.91倍，此外，T4、T5時期SiNPR3、SiNPR4表達上調，而SiNPR2表達下調；谷穗中SiNPR1、SiNPR2、SiNPR4在T5時期表達量顯著上調，SiNPR3顯著下調，表明SiNPR1、SiNPR4可能在谷子抗禾生指梗霉侵染過程中起正調控作用；SiNPR2在葉中特異高表達，推測其可能參與谷子的生長發育與形態建成。盡管SiNPR3與AtNPR5、AtNPR6同源，但在各組織中均不表達，其功能有待進一步確定。

本研究通過BLASTP從xiaomi數據庫中共鑒定到4個谷子NPR1基因，命名為SiNPR1～SiNPR4，生物信息學分析表明，SiNPR1定位于細胞核內，SiNPR4定位于葉綠體中，均含有SA響應元件。經進化分析及轉錄組分析可知，SiNPR1與OsNPR1的同源性最高，在禾生指梗霉侵染后T5時期的葉、穗均顯著上調，推測SiNPR1參與激活谷子SA介導的SAR表現。此外，SiNPR2、SiNPR4與AtNPR3、AtNPR4同源，且均定位于葉綠體，其中，SiNPR2在禾生指梗霉侵染谷子后的葉T1～T5時期均下調表達，推測在谷子抗禾生指梗霉反應中起負調控作用；SiNPR4在禾生指梗霉侵染后T5時期的葉、穗均顯著上調，推測其可能抵御卵孢子形成。本研究結果可為進一步探究谷子的生長發育及抗病機制提供一定的參考依據。