魔芋不同生理狀態的愈傷組織和叢生芽內源激素及抗氧化酶研究

蔡陽光，段龍飛，覃劍鋒，郭邦利，陳國愛，張百忍

安康市農業科學研究院， 陜西 安康 725021

植物的生長過程是植物內源各激素水平間的動態平衡過程， 內源激素對植物愈傷組織生長和分化有調控作用[1]． 但在誘導植物組織分化過程中， 內外源激素之間存在相互作用， 外源激素與內源激素的種類和水平有著密切的關系， 并通過多種機理實現相互作用， 一起構成了一個非常精細而復雜的調控網絡[2-4]． 通過外源激素的適時適量運用， 可使植物體內的生理生化反應以及激素水平和種類發生顯著的變化， 進而調控作物的源庫關系[5-7]． 王京偉等[8]研究發現， 內外源激素協同調控山丹小鱗莖的分化方向， 且在培養過程中發現， 添加的外源激素不同， 小鱗莖的形態變化也不相同， 對應的內源激素水平也發生了一定的變化． 李本波[9]在杜梨愈傷誘導發生的研究中指出， 外源激素和內源激素在杜梨愈傷組織培養中有著較強的相互作用， 添加不同的單一外源激素， 可促進杜梨內源激素的合成， 同時還可以引起激素間的比值發生變化； 且不同外源激素對杜梨愈傷組織內源激素影響存在一定的差異， 內源激素水平或不同內源激素間比值與不添加外源激素的愈傷組織間差異有統計學意義．

魔芋作為地下球莖類作物， 其離體器官發生形式與內源激素變化及平衡水平相關[10]． 吝祥根[11]研究指出， 在細胞分化過程中， 高水平的內源ZR，ZR/IAA比值以及適量的IAA和GA3有利于花魔芋愈傷組織細胞的分化， 而ABA不利于愈傷組織細胞的分化； POD α-淀粉酶和PAL活性增加有利于愈傷組織細胞的再分化， 這些酶可能是以提高細胞的代謝水平以及提供細胞分化所需要的物質和能量的方式， 發揮其對細胞分化的促進作用． 黃丹楓等[12-14]研究指出， 異戊烯基嘌呤類(iPAs)CTK是決定魔芋細胞分化和器官發生的內源激素； 細胞內異戊烯基嘌呤類細胞分裂素質量分數的上升與不定芽發生呈正相關， 培養基中細胞分裂素類物質的種類和濃度， 影響魔芋愈傷組織細胞內iPAs的生物合成， 從而影響魔芋愈傷組織的細胞分化、 器官發生和植株再生； 另外， 內源細胞分裂素iPAs與魔芋不定芽分化正相關， 通過促進遺傳物質的合成， 提高CAT，PAL，POX酶活性而起作用， 同時分化培養基中適宜的6-BA，IAA濃度與iPAs，CAT活性正相關， 也促進了魔芋不定芽的分化． 胡建斌等[15]對不同類型的魔芋愈傷組織研究后發現， 只有結構致密且表面呈瘤狀的愈傷組織(Ⅲ型)才能誘導形成微型薯， 其他類型的愈傷組織(Ⅰ型， Ⅱ型)則傾向于形成不定芽； 進一步研究兩種途徑的愈傷組織中的內源激素發現， 赤霉素與茉莉酸的平衡是調控魔芋離體形態建成的主要因素． 魔芋是我國西部山區重要的特色經濟作物， 繁殖系數低， 組織培養是快繁和優質種質保存的重要途徑． 目前魔芋組培主要經過外植體脫分化和再分化進行， 在脫分化和再分化過程中， 受遺傳因素、 培養條件、 生理狀態、 激素以及次生代謝物質的影響， 愈傷組織和叢生芽形態多樣化且頻率不一致， 如褐化、 僵化、 老化和玻璃化等， 會對后續的繼代培養和形態建成產生不利影響． 另外對魔芋離體細胞脫分化、 再分化和形態建成的內在機制及其調控機制， 內源激素對魔芋離體再生的影響及其作用機制， 以及各激素間相互影響均需進一步驗證[16-17]． 本研究以遺傳同質、 生理狀態不同的魔芋愈傷組織和叢生芽作為研究對象， 通過測定其內源激素的質量分數以及SOD，POD，CAT酶的活性， 分析其相關性， 探明內源激素對形態建成的影響， 為定向調控奠定基礎．

1 材料與方法

1.1 試驗材料

雜交魔芋品種“安魔128”， 安康市農業科學研究院自主選育的魔芋品種， 2019年種植于該院示范園魔芋繁育基地， 常規管理， 選取3齡球莖作為外植體組培， 挑選同期不同生長及分化狀態的愈傷組織和叢生芽作為檢測材料．

1.2 組織培養

試驗于2020年4月23日在安康市農業科學研究院魔芋組培中心進行． ① 選取1.21 kg健康無外傷的“安魔128”球莖， 清洗消毒后， 將其均勻切成1 cm3大小， 接種于愈傷組織誘導培養基中： MS+2.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L 2，4-D+0.2 mg/L NAA+4.2 mg/L瓊脂+30 g/L蔗糖， pH值為5.8～6.0， 每瓶接種1塊， 共227瓶； ② 培養至32 d， 挑選3種不同生長狀態的愈傷組織進行內源激素及酶活檢測， 每個處理挑選10瓶； ③ 同時挑選質地堅硬、 表面呈顆粒狀的愈傷組織， 平均切分成2塊， 接種于芽分化誘導培養基中： MS+3.0 mg/L 6-BA+1.0 mg/L KT+0.2 mg/L 2，4-D+0.5 mg/L NAA+4.2mg/L瓊脂+20 g/L蔗糖， pH值為5.8～6.0， 每瓶接種1塊， 共169瓶； ④ 培養至40 d， 挑選不同分化狀態的叢生芽進行內源激素及酶活檢測， 每個處理挑選10瓶．

1.3 測定指標及方法

2020年5月24日挑選3種類型愈傷組織進行檢測， 每種類型挑選10瓶， 愈傷組織平均9.49 g/個． 2020年7月3號挑選5種類型叢生芽進行檢測， 每種類型挑選10瓶， 叢生芽平均7.53 g/個． 采用高效液相色譜法[18-19]測定GA3，ABA質量分數； 采用酸性茚三酮法[20]測定脯氨酸(Pro)質量分數， 硫代巴比妥酸顯色法[21]測定MDA質量分數； 采用對鄰苯三酚自氧化法[22]測定超氧化物歧化酶(SOD)的活性， 參照陳建勛等[23]的方法測定過氧化物酶(POD)的活性， 紫外分光光度法[24]測定過氧化氫酶(CAT)的活性．

采用酶聯免疫分析(ELISA)試劑盒測定6-BA，KT，2，4-D及NAA的質量分數： 取0.5 g經液氮處理后的樣品， 充分研磨， 加入PBS， 2 000～3 000 r/min離心20 min， 收集上清液后分裝， 留1份待測， 其余保存于4 ℃冰箱備用． 往預先包被6-BA，KT，2，4-D及NAA捕獲抗體的微孔中， 依次加入標本、 標準品、 HRP標記的檢測抗體， 經過溫育并徹底洗滌． 用底物TMB顯色， TMB在過氧化物酶的催化下轉化成藍色， 并在酸的作用下轉化成最終的黃色． 顏色的深淺和樣品中各激素的多少呈正相關． 用酶標儀在450 nm 波長下測定吸光度(OD值)， 計算樣品濃度， 用標準品做對照計算各指標的質量分數， 每個處理重復測定3次．

1.4 數據統計與分析

用Excel 2003與SPSS 19.0軟件進行數據整理與統計分析．

2 結果與分析

2.1 不同類型魔芋愈傷組織生理指標分析

由表1可知， 魔芋愈傷組織類型3的GA3，Pro質量分數及抗氧化酶SOD，CAT活性均顯著高于其他2種類型， 同時ABA，MDA質量分數均較低， 表明愈傷組織類型3較類型1和類型2生長更旺盛， 這與圖1中的外在表現較一致． 類型3愈傷組織分化效果最好， 質地堅硬松散， 表面有顆粒狀， 呈粉綠色； 類型2分化效果良好， 但質地較軟呈水漬狀， 表面暗紅色； 類型1分化不完全， 質地堅硬不松散， 且伴有褐化現象．

從表1中還可以看出， 愈傷組織類型3中4種內源激素質量分數均顯著高于類型1和類型2， 且各激素6-BA， KT， 2，4-D， NAA的比例為114∶80∶68∶100， (6-BA+KT+2，4-D)與NAA的比值R=2.62∶1(類型3)<2.71∶1(類型2)<2.89∶1(類型1)． 4種內源激素水平間差異有統計學意義， 且當(6-BA+KT+2，4-D)與NAA的比值R≤2.62時， 有利于魔芋球莖愈傷組織的分化． 同時， 在誘導脫分化形成愈傷組織的過程中， 單獨使用2，4-D也可誘導愈傷組織的形成， 但形成的愈傷組織較松軟， 難分化； 而使用中低濃度的2，4-D配合6-BA(KT)對加速細胞分裂快速形成胚性愈傷具有明顯的作用．

表1 3種類型魔芋愈傷組織生理指標比較

圖1 3種不同生長狀態的魔芋愈傷組織

2.2 不同類型魔芋叢生芽生理指標分析

由表2可知， 類型3魔芋叢生芽GA3，Pro的質量分數及抗氧化酶活性均較高， 且ABA，MDA質量分數均較低， 較其他類型叢生芽差異有統計學意義． 結合圖2叢生芽分化的外在表現， 表明該類型芽處于生理旺盛階段． 類型1叢生芽由于褐化影響了正常的分化和生長； 類型2叢生芽出現了老化現象， 再生頻率低； 類型4叢生芽與類型3相比， GA3，CAT質量分數較低， 導致有效芽分化數相對較少； 類型5叢生芽SOD活性最高， 同時ABA，MDA質量分數也較高， 而GA3，Pro質量分數及CAT活性相對較低， 可能細胞膜受到氧自由基的傷害， 從而形成外在的玻璃化狀態以及顯示邊緣水漬狀．

表2 5種類型魔芋叢生芽生理指標比較

由表2還可以了解到， 不同類型魔芋叢生芽內源激素水平有差異， 類型3各激素6-BA， KT， 2，4-D， NAA的比例為119∶79∶72∶100， (6-BA+KT+2，4-D)與NAA的比值R=2.70∶1， 其中2.37∶1(類型5)<2.53∶1(類型1)<2.62∶1(類型4)<2.70∶1(類型3)<3.12∶1(類型2)． 說明對于魔芋叢生芽分化而言， 細胞分裂素和生長素總的比值應維持在適宜水平， 比值過高(類型2)， 易出現老化芽現象； 比值過低又會導致分化慢， 分化不完整． 另外， 僅KT和NAA差異顯著的類型3和類型4， 芽的分化數量和形態也有差異．

在圖2中， 類型3芽密， 質地堅硬松散， 芽頭呈嫩綠色； 類型4芽密， 呈松散狀， 芽頭多呈粉紅色； 類型1芽少， 質地較硬不松散， 伴有部分褐化； 類型2芽密， 質地較硬不松散， 芽頭大多呈淺粉色， 并且芽外形呈花瓣狀， 難以形成有效苗； 類型5芽密， 質地偏軟不松散， 芽較長且呈白色或透明狀， 幼苗細弱且葉片呈水漬狀， 即玻璃化．

圖2 5種不同生理狀態魔芋叢生芽

2.3 魔芋愈傷組織內源激素質量分數及抗氧化酶相關性分析

由表3可知， 內源激素KT和NAA質量分數之間呈極顯著負相關， 6-BA和2，4-D質量分數之間呈極顯著正相關． 6-BA，2，4-D與POD活性之間呈極顯著正相關， 與SOD活性之間呈顯著負相關． NAA與SOD，CAT活性之間呈顯著正相關， 2，4-D與CAT活性之間呈顯著負相關． SOD與CAT之間呈極顯著正相關， 而與POD之間呈極顯著負相關． ABA，Pro和MDA與衰老和逆境脅迫有關， 與NAA呈極顯著正相關， 與KT呈負相關， 較低的NAA和較高的KT水平有利于愈傷組織的增殖．

表3 魔芋愈傷組織生理指標的相關性分析

2.4 魔芋叢生芽內源激素質量分數及抗氧化酶相關性分析

由表4可知， 內源激素KT與2，4-D，6-BA之間均呈極顯著正相關， 6-BA，KT及2，4-D與SOD，POD活性之間均呈極顯著或顯著正相關． KT，2，4-D及NAA質量分數與CAT活性之間均呈顯著或極顯著正相關， 保護酶SOD與CAT，POD活性之間呈顯著或極顯著正相關． 另外， SOD，CAT，GA3及Pro與MDA之間呈顯著或極顯著負相關， Pro與CAT之間呈極顯著正相關． 表明KT與2，4-D，6-BA之間相互促進， 且內源各激素質量分數的增加會促進相關抗氧化酶活性的增高； 同時抗氧化酶與相關生理物質間存在相互促進與抑制作用． 6-BA與ABA呈極顯著正相關， NAA與ABA呈極顯著負相關， 較低的6-BA和較高的NAA有利于芽的分化．

表4 魔芋叢生芽生理指標的相關性分析

3 討論

劉清等[25]研究指出， 內源激素對水稻愈傷組織的生理表現有著極其重要的影響， 其種類、 質量分數及協調平衡是水稻愈傷組織形成和分化的關鍵． 合適的濃度和比例能有效促進外植體的脫分化與再分化， 并協同促進細胞的分裂、 分化和生長[26]． 郭敏敏等[27]通過測定棉花愈傷組織中的內源激素后發現， 不同內源激素適宜的濃度和比例調節外植體的脫分化和再分化， 各種激素協同作用促進細胞的生長和分化． 本研究也發現， 對于魔芋愈傷組織和叢生芽的分化， 內源細胞分裂素和生長素的總比值應維持在相對適宜的水平， 且不同組織各細胞分裂素的作用也有主次之分； 如6-BA， KT， 2，4-D質量分數太高會影響愈傷組織和叢生芽的分化， 導致組織的老化； NAA在一定濃度范圍內， 可促進組織的生長分化和提高抗氧化的作用． 肖關麗等[28]發現， 植物組織培養過程中的各種變化與內源激素種類、 水平及配比具有重要關系， 包括對胚性細胞及體胚的形成， 以及愈傷組織分化芽和根等均具有顯著影響． 適當提高內源激素NAA質量分數或提高6-BA/NAA， KT/NAA以及(6-BA+KT+2，4-D)/NAA的比值能顯著促進愈傷組織及叢生芽的生長分化， 2，4-D與NAA的比值較大對促進叢生芽分化有抑制作用． 王秀紅[29]研究指出， 內源激素的質量分數和配比是影響愈傷組織誘導率和綠苗分化率的關鍵因素之一， 表現為IAA和GA呈負效應， ABA，Z+ZR呈正效應； 同時， 內源激素的配比對愈傷組織誘導率和綠苗分化率也有一定作用， 表現為IAA/Z+ZR對愈傷誘導率有一定的正效應， Z+ZR/IAA，ABA/IAA對綠苗分化率呈顯著正相關． 有研究證實， 魔芋細胞內CTK，IAA的代謝變化是細胞分化、 器官發生的調節因子和物質基礎， 培養基中激素種類和濃度通過影響內源激素的代謝而起作用， 且影響魔芋細胞分化的內源CTK主要是iPAs類[30]， 這與本研究結果基本一致． 另外， 魔芋細胞分化、 器官發生的生化反應順序是： 激素代謝， RNA及DNA合成代謝， 蛋白質合成酶系統反應． 本研究也發現， 不同內源激素與抗氧化酶間均存在直接或間接相關作用， 同時與其他生理物質間也存在著相互作用， 從而共同影響愈傷組織和叢生芽的分化和外在形態．