FR+-CTC、ANXA2、ProGRP與肺癌臨床病理特征的相關性

柳行強，寧立芬，李 琳，陳忠成

（武漢科技大學附屬漢陽醫院檢驗科，湖北 武漢 430050）

目前，肺癌已成為發病率、死亡率最高的惡性腫瘤，2020年全球新發肺癌220.7萬例，死亡179.6萬例[1]。肺癌患者的5年生存率低于15%，大多數患者就診時已處于晚期[2]。雖然肺癌的治療方法已取得到了較大的進展，但仍缺乏有效的預后判斷指標，導致預后較差[3]。因此，尋找肺癌復發或轉移的判斷指標，對改善患者預后、提高治愈率具有重要意義。葉酸受體（folate receptor，FR）是一種糖基磷脂酰基醇偶聯蛋白，正常人血液中無表達，是理想的肺癌循環腫瘤細胞（circulating tumor cell，CTC）的檢測靶點[4]。膜聯蛋白A2（annexin A2，ANXA2）是膜聯蛋白家族重要成員之一，其異常表達與腫瘤的侵襲和轉移密切相關[5]。胃泌素釋放肽前體（gastrin-releasing peptide precursor，ProGRP）能夠通過細胞間相互作用或自身分泌導致更具侵略性的腫瘤行為和患者更短的生存期[6]。本研究擬探討葉酸受體陽性循環腫瘤細胞（folate receptor positive circulating tumor cell，FR+-CTC）、ANXA2、ProGRP在肺癌中的臨床價值。

1 材料和方法

1.1 研究對象

選取2018年1月—2019年12月武漢科技大學附屬漢陽醫院肺癌患者116例，其中男76例、女40例，年齡（58.8±8.7）歲。納入標準：（1）符合《中國肺癌篩查與早診早治指南（2021，北京）》[7]中關于原發性肺癌的診斷標準；（2）經病理學、影像學確診；（3）卡氏功能量表（Karnofsky performance status，KPS）評分＞60分，且預計生存期＞6個月；（4）未進行放化療治療、靶向治療等；（5）臨床資料完整。排除標準：（1）嚴重肝、腎功能不全；（2）合并免疫系統、血液系統疾病；（3）合并其他惡性腫瘤；（4）妊娠和哺乳期婦女；（5）合并精神疾病。根據肺癌TNM分期標準[8]分為Ⅰ期40例、Ⅱ期38例、Ⅲ期30例、Ⅳ期8例。另選取同期武漢科技大學附屬漢陽醫院肺部良性疾病患者100例作為對照組，其中男65例、女35例，年齡（59.2±8.6）歲。肺部良性疾病患者均經組織病理學及影像學確診，既往無惡性腫瘤史。2個組之間性別和年齡差異均無統計學意義（P＞0.05）。本研究經武漢科技大學附屬漢陽醫院倫理委員會批準，所有對象均知情同意。

1.2 方法

收集所有患者的一般臨床資料，包括年齡、性別、影像學報告、血液學檢查報告等。采集所有患者入院第2天清晨空腹靜脈血6 mL，其中3 mL采用乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA）抗凝，用于檢測FR+-CTC；另3 mL置于無添加劑的干燥真空管中，1 006×g離心10 min后分離血清，用于檢測ANXA2、ProGRP水平。（1）FR+-CTC檢測。采用免疫磁珠負向富集法捕獲EDTA抗凝血樣本中的CTC，采用配體靶向聚合酶鏈反應技術檢測FR+-CTC水平。3 mL血液中檢測到1個FR+-CTC即判定為1 FU，陽性判斷標準為≥8.7 FU/3 mL。試劑盒購自格諾思博生物科技（上海）有限公司，檢測儀器為ABI 7300實時熒光定量PCR儀（美國ABI公司）。（2）ANXA2檢測。采用酶聯免疫吸附試驗檢測血清ANXA2水平，試劑盒購自上海希美化學有限公司，檢測儀器為Multiskan FC酶標儀（美國ThermoFisher Scientific公司）。以ANXA2＞26 ng/mL為陽性。（3）其他指標檢測。采用ARCHITECT i2000全自動化學發光免疫分析儀（美國雅培公司）及配套試劑檢測ProGRP、細胞角蛋白19片段（cytokeratin 19 fragment，CYFRA21-1）、神經元特異性烯醇化酶（neuron specific enolase，NSE）、鱗狀上皮細胞癌抗原（squamous cell carcinoma antigen，SCC-Ag）。以ProGRP＞69.2 pg/mL為陽性。所有項目均嚴格按儀器和試劑盒說明書進行操作。

1.3 統計學方法

采用SPSS 21.0軟件進行統計分析。呈正態分布的計量資料以±s表示，2個組之間比較采用t檢驗。采用受試者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線評價各項指標診斷肺癌的效能。采用Spearman相關分析評估各指標間的相關性。采用多因素Logistic回歸分析評估肺癌發生的危險因素。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 肺癌組與對照組FR+-CTC、ANXA2、ProGRP水平比較

肺癌組FR+-CTC、ANXA2、ProGRP水平顯著高于對照組（P＜0.05）。見表1。

表1 肺癌組與對照組FR+-CTC、ANXA2、ProGRP水平比較

2.2 FR+-CTC、ANXA2、ProGRP單項及聯合檢測診斷肺癌的效能

采用Logistic回歸分析建立FR+-CTC、ANXA2、ProGRP聯合檢測的方程：Logist（P）=4.26×ProGRP+1.34×ANXA2+1.09×FR+-CTC-5。ROC曲線分析結果顯示，FR+-CTC、ANXA2、ProGRP單項及聯合檢測診斷肺癌的曲線下面積（area under curve，AUC）分別為0.885、0.810、0.696、0.935。見表2、圖1。

表2 FR+-CTC、ANXA2、ProGRP單項及聯合檢測診斷肺癌的效能

圖1 FR+-CTC、ANXA2、ProGRP診斷肺癌的ROC曲線

2.3 FR+-CTC、ANXA2、ProGRP與CYFRA21-1、NSE、SCC-Ag的相關性

Spearman相關分析結果顯示，FR+-CTC、ANXA2、ProGRP與CYFRA21-1、NSE、SCCAg均呈正相關（P＜0.05）。見表3。

表3 FR+-CTC、ANXA2、ProGRP與CYFRA21-1、NSE、SCC-Ag的相關性分析

2.4 FR+-CTC、ANXA2、ProGRP在肺癌患者不同臨床病理特征中的表達

根據不同臨床病理特征對肺癌患者進行分組。結果顯示，FR+-CTC、ANXA2、ProGRP在有吸煙史、TNM分期為Ⅲ～Ⅳ期、腫瘤直徑≥5 cm、低分化、有淋巴結轉移、有遠隔轉移的患者中明顯升高（P＜0.05）。見表4。

表4 不同臨床病理特征肺癌患者FR+-CTC、ANXA2、ProGRP水平比較

2.5 影響肺癌發生的危險因素分析

以是否發生肺癌為因變量（否=0，是=1），以FR+-CTC、ANXA2、ProGRP陽性表達為自變量，進行多因素Logistic回歸分析。結果顯示，FR+-CTC、ANXA2和ProGRP陽性均是肺癌發生的危險因素[比值比（odds ratio，OR）值分別為1.385、1.774、1.823，95%CI分別為1.187～4.974、1.601～5.075、1.677～6.005]。見表5。

表5 肺癌發生的危險因素分析

3 討論

肺癌是起源于支氣管黏膜或支氣管腺體的一種惡性腫瘤，是多種因素共同作用的結果，常見病因有吸煙、職業暴露、慢性肺炎等[9]。肺癌的發病率位居我國惡性腫瘤的首位，而且發病年齡呈現年輕化的趨勢[10]。肺癌患者發病初期多出現發熱、咳嗽、胸痛、氣短、咯血等癥狀，容易與其他肺部疾病混淆，造成漏診、誤診，多數患者就診時已發展為晚期。肺癌晚期患者的5年生存率僅為5%，而早期肺癌患者的5年生存率可達57%[11]。雖然病理組織活檢是診斷肺癌的金標準，但部分患者存在依從性差或不宜手術的情況，取樣比較困難。因此，尋求靈敏度高、無需手術的診斷指標，對肺癌患者的早期診療尤為重要。

CTC是從實體腫瘤或轉移病灶進入人體外周血液的腫瘤細胞。CTC檢測是目前最新的液體活檢技術，具有方便、快捷、重復性好的特點，適用于腫瘤的早期診斷。隨著腫瘤細胞的不斷浸潤和轉移，腫瘤細胞可以通過結締組織間隙或破裂的毛細血管進入血液循環，形成CTC[12]。葉酸是一種水溶性的B族維生素，人體自身不能合成，必須從外界攝取，通過與細胞表面葉酸受體結合而進入細胞內。葉酸受體在腫瘤細胞中高表達，尤其是肺癌和卵巢癌等多種上皮性腫瘤細胞，而正常組織幾乎不表達或低表達。目前，葉酸受體已成為檢測人體內CTC的理想靶點[13]。唐興等[14]發現，FR+-CTC可作為肺癌篩查的指標。ZHOU等[15]認為，FR+-CTC檢測是鑒別不明原因肺部孤立結節惡性程度的可靠方法，FR+-CTC計數和熱成像診斷技術的聯合應用可能會增強術前對肺結節侵襲性的判斷，避免非侵襲性病變患者的過度治療。CHEN等[16]報道，FR+-CTC還可作為預測晚期NSCLC患者化療效果的潛在的生物標志物。ANXA2是來源于與鈣離子相關的蛋白質家族，參與維持肌動蛋白介導的細胞骨架，而細胞骨架的改變與腫瘤的增殖、進展、轉移相關[17]。ProGRP是一種胃腸激素，廣泛存在于肺組織神經內分泌細胞中，主要作用是刺激G細胞產生胃泌素、收縮平滑肌、促進細胞間相互作用、調節腫瘤轉移和生長。ProGRP在小細胞肺癌中顯著升高，可用于鑒別肺癌的病理類型[18]。本研究結果顯示，肺癌患者FR+-CTC、ANXA2、ProGRP水平顯著升高，提示這些指標可能參與了肺癌的發生、發展；ROC曲線分析結果顯示，FR+-CTC、ANXA2、ProGRP聯合檢測可以提高肺癌的診斷效能。

本研究結果還顯示，FR+-CTC、ANXA2、ProGRP水平與吸煙史、TNM分期、腫瘤直徑、分化程度、淋巴結轉移、遠隔轉移明顯相關（P＜0.05），FR+-CTC、ANXA2、ProGRP陽性表達是肺癌發生的危險因素。因此，通過檢測FR+-CTC、ANXA2、ProGRP水平有助于了解肺癌患者的臨床病理特征和轉移情況，評估患者的病情進展和治療效果。

綜上所述，肺癌患者FR+-CTC、ANXA2、ProGRP水平明顯升高，且與臨床病理特征及腫瘤轉移密切相關，是肺癌發生的獨立危險因素，聯合檢測有利于患者的早期診斷、病情評估及預后判斷。但本研究屬于回顧性研究，標本量較小，且來自同一個地區，可能存在一定地域偏差，有待日后進行大樣本量、多中心研究，以期為肺癌的診斷及預后提供全新思路。