腸道定植CRE篩查技術(shù)方法學(xué)評價

徐 琪，潘 芬，孫 燕，石迎迎，于方圓，張 泓

（上海交通大學(xué)附屬兒童醫(yī)院 上海市兒童醫(yī)院檢驗科，上海 200062）

近年來，碳青霉烯類耐藥腸桿菌科細菌（carbapenem-resistantEnterobacteriaceae，CRE）在世界范圍內(nèi)廣泛播散，臨床分離率逐年上升，成為公眾健康的一大威脅[1]。腸桿菌科細菌主要存在于人體的腸道，有研究發(fā)現(xiàn)，腸道定植CRE是導(dǎo)致腸道感染或繼發(fā)機體其他部位感染的重要危險因素[2]，且相較于院內(nèi)傳播，更多感染發(fā)生于既往腸道定植陽性的患者中[3]。因此，對入院患者實施主動篩查顯得尤為重要。主動篩查對于早期發(fā)現(xiàn)腸道定植CRE具有重要意義，對篩查陽性的患者及早干預(yù)，不僅可以有效控制CRE在醫(yī)院范圍內(nèi)的流行和播散，還可以縮短患者住院時間，降低臨床病死率[4]。主動篩查配合患者合理安置和接觸隔離，已被證實可以明顯減少兒童患者CRE的感染與定植[5]。

目前，國際上采用的CRE主動篩查的方法較多，主要包括美國疾病預(yù)防控制中心推薦方案、各種商品化顯色培養(yǎng)基培養(yǎng)法、含碳青霉烯類抗菌藥物的篩選法和分子檢測技術(shù)。臨床實驗室檢測糞便樣本中的CRE主要面臨三大挑戰(zhàn)：快速檢測、低碳青霉烯類耐藥菌株的檢測和低水平CRE的檢測[6]。感染控制的成效體現(xiàn)在對CRE檢測陽性的患者早期進行接觸隔離，這就要求盡早檢出CRE，并及時采取措施。因此，一個良好的篩查試驗必須盡量減少周轉(zhuǎn)時間，最大限度地提高靈敏度，保持合理的特異性。美國疾病預(yù)防控制中心推薦采用肉湯法，但這一方法僅可用于乳糖發(fā)酵的腸桿菌科細菌的篩查，且操作繁瑣，耗時長（約4 d）；商品化顯色培養(yǎng)基培養(yǎng)法較肉湯法好，但不同流行地區(qū)性能評價差異較大、成本高，且尚未獲批用于臨床；含碳青霉烯類抗菌藥物的篩查方法存在暫無最佳藥物種類、濃度及抑菌圈大小統(tǒng)一標準的弊端；分子檢測技術(shù)對CRE的快速檢測具有較高的靈敏度和可靠性，且被美國臨床實驗室標準化協(xié)會（the Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）推薦作為檢測產(chǎn)碳青霉烯酶腸桿菌科細菌的試驗方法之一，但是需要特殊的試劑和設(shè)備，且檢測結(jié)果依賴特異性靶基因，若待測基因與目標基因不同，會導(dǎo)致假陰性。本研究從臨床應(yīng)用的可行性和可靠性出發(fā)，以聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）法為參考方法，評價使用含1 μg/mL美羅培南的麥康凱瓊脂平板（藥物篩選法）和粘貼10 μg美羅培南紙片的麥康凱瓊脂平板（紙片篩選法）對臨床糞便樣本進行CRE篩查的效能，以期為臨床實驗室選用合適的技術(shù)篩查CRE提供參考。

1 材料和方法

1.1 研究對象

收集2019年7月—2020年3月上海市兒童醫(yī)院臨床送檢主動篩查CRE的住院患兒糞便樣本306例。

1.2 儀器和試劑

基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜儀（美國Bruker公司），PCR擴增儀（德國Eppendorf公司），凝膠成像系統(tǒng)（美國Bio-Rad公司），麥康凱瓊脂平板（上海伊華醫(yī)學(xué)科技有限公司），10 μg美羅培南紙片（英國OXIOD公司），麥康凱瓊脂干粉和美羅培南藥粉（上海遠慕生物科技有限公司），一次性培養(yǎng)皿（浙江柏美特醫(yī)用塑料有限公司），2×Hieff PCR Master Mix（上海翊圣生物科技有限公司），D2000 DNA Marker[天根生化科技（北京）有限公司]。質(zhì)控菌株為大腸埃希菌（ATCC 25922，購自上海市臨床檢驗中心）和經(jīng)本實驗室測序證實為產(chǎn)NDM-5的產(chǎn)氣腸桿菌。

1.3 方法

1.3.1 PCR法 采用煮沸法提取細菌DNA，參考文獻[7-11]設(shè)計引物，擴增8種我國常見的碳青霉烯酶基因（blaKPC、blaNDM、blaIMP、blaOXA-48、blaVIM、blaGIM、blaDIM、blaAIM），擴增產(chǎn)物經(jīng)電泳出現(xiàn)陽性條帶且通過測序確認為碳青霉烯酶基因為篩查陽性，反之則為陰性。

1.3.2 藥物篩選法 挑取3～5 g糞便樣本，分區(qū)接種于含1 μg/mL美羅培南的麥康凱瓊脂平板，置于5% CO2、（35±2）℃環(huán)境下培養(yǎng)18～24 h，觀察菌落生長情況。若有菌落生長，且生長情況良好，判斷為篩查陽性，反之則為陰性。

1.3.3 紙片篩選法 挑取3～5 g糞便樣本，分區(qū)接種于麥康凱瓊脂平板上，再將含10 μg美羅培南的紙片貼于平板一區(qū)，置于5% CO2、（35±2）℃環(huán)境下培養(yǎng)18～24 h，測量抑菌圈直徑，判讀標準參照2019年CLSI M100-S29文件。以抑菌圈直徑≤19 mm為篩查陽性，＞19 mm則為陰性。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 20.0軟件進行統(tǒng)計分析。計數(shù)資料用例/率表示。采用Kappa檢驗評價不同方法檢測結(jié)果的一致性。

2 結(jié)果

2.1 3種方法CRE檢測結(jié)果

306例糞便樣本中，有37例PCR法檢測為陽性，陽性率為12.1%（37/306），其中以產(chǎn)blaNDM-5酶的產(chǎn)氣腸桿菌為主，占35.1%（13/37）。PCR法陽性CRE菌株碳青霉烯酶基因型分布及藥物篩選法和紙片篩選法結(jié)果見表1。有6例樣本藥物篩選法和紙片篩選法結(jié)果均為陽性，但PCR法未檢測到碳青霉烯酶基因。

2.2 藥物篩選法

306例糞便樣本中，有53例藥物篩選法CRE陽性，陽性率為17.32%（53/306）。經(jīng)培養(yǎng)分別為大腸埃希菌（15例）、產(chǎn)氣腸桿菌（13例）、肺炎克雷伯菌（12例）、陰溝腸桿菌（10例）、奇異變形桿菌（2例）和弗勞地檸檬酸桿菌（1例），其中36株為產(chǎn)酶菌株（表1），17株未檢測到酶型。藥物篩選法和PCR法一致性程度較好（Kappa值為0.77，P＜0.05），敏感性、特異性、陽性預(yù)測值、陰性預(yù)測值和符合率分別為97.3%、93.7%、67.9%、99.6%和94.1%。

2.3 紙片篩選法

306例糞便樣本中，有47例紙片篩選法CRE陽性，陽性率達15.4%（47/306）。經(jīng)培養(yǎng)分別為產(chǎn)氣腸桿菌（14例）、大腸埃希菌（12例）、肺炎克雷伯菌（9例）、陰溝腸桿菌（9例）、弗勞地檸檬酸桿菌（2例）和奇異變形桿菌（1例）。其中34株為產(chǎn)酶株（表1），13株未發(fā)現(xiàn)碳青霉烯酶基因。紙片篩選法和PCR法CRE一致性程度較強（Kappa值為0.78，P＜0.05），篩查的敏感性、特異性、陽性預(yù)測值、陰性預(yù)測值和符合率分別為91.9%、95.2%、72.3%、98.8%和94.8%。

表1 PCR法陽性菌株碳青霉烯酶基因型分布及藥物篩選法、紙片篩選法CRE篩查結(jié)果 例

3 討論

CRE的耐藥機制包括產(chǎn)碳青霉烯酶、高產(chǎn)AmpC酶或超廣譜β-內(nèi)酰胺酶合并膜孔蛋白缺失、外排泵過度表達，以及青霉素結(jié)合蛋白突變等，其中最主要的耐藥機制為產(chǎn)碳青霉烯酶，KPC-2、NDM和OXA-48樣酶是目前我國CRE臨床分離株中最為常見的3種碳青霉烯酶型別[12]。同樣，這3種酶型在糞便樣本分離的CRE菌株中也最為常見[13-14]。盡管檢測效能不一，表型檢測和分子技術(shù)均能夠識別出產(chǎn)碳青霉烯酶的腸桿菌科細菌。對感染者和攜帶者進行篩查是預(yù)防CRE傳播的2個主要途徑。分子檢測技術(shù)可靠性強，且能對碳青霉烯酶分型，可有效指導(dǎo)臨床抗感染治療，但需要特殊設(shè)備，對操作人員技術(shù)要求高，操作繁瑣、耗時，成本較高，不適合在基層臨床實驗室推廣使用。有學(xué)者指出，目前對于CRE攜帶者的篩查仍然主要依賴于篩選培養(yǎng)基[15]。本研究將臨床送檢主動篩查CRE的糞便樣本直接接種于含1 μg/mL美羅培南的麥康凱瓊脂培養(yǎng)基上，或在樣本接種的一區(qū)粘貼10 μg美羅培南紙片，結(jié)果顯示，藥物篩選法篩查CRE的敏感性和特異性分別為97.3%和93.7%，紙片篩選法篩查CRE的敏感性、特異性分別為91.9%和95.2%，且2種方法與PCR法的一致性均較好。此外，這2種方法還具有操作簡便、成本低，可較快獲得檢測結(jié)果，易于在基層實驗室推廣等優(yōu)點。本研究還發(fā)現(xiàn)，藥物篩選法和紙片篩選法對于產(chǎn)KPC酶腸桿菌科細菌的篩查效能均較強，可能與此產(chǎn)酶菌株高水平耐藥有關(guān)[16-17]，對于以產(chǎn)KPC-2酶CRE為主的醫(yī)療機構(gòu)適用性更強。在臨床應(yīng)用上，無論從成本、技術(shù)，還是從可行性、可靠性出發(fā)，2種含碳青霉烯類抗菌藥物的篩選法性能均優(yōu)于或至少可以與其他篩選方法相媲美，可及時有效地指導(dǎo)臨床抗感染防控工作的開展。

另外，本研究結(jié)果顯示，將美羅培南紙片抑菌圈直徑≤19mm判定為紙片篩選法陽性，敏感性低于藥物篩選法，可能與糞便樣本中存在大量其他病原菌或CRE菌株總量較低有關(guān)[4]。有研究發(fā)現(xiàn)，通過在麥康凱瓊脂培養(yǎng)基上粘貼藥敏紙片來檢測產(chǎn)A類或B類酶的CRE時，檢測限均較其他篩選培養(yǎng)基高1～2個對數(shù)值[18-19]；也可能與指定篩選陽性的紙片抑菌圈直徑大小有關(guān)，BLACKBURN等[20]將美羅培南抑菌圈直徑≤34 mm作為判定標準，發(fā)現(xiàn)菌量在102～104CFU/mL時敏感性均≥95%。但2種篩選方法在篩查產(chǎn)金屬酶CRE上均存在一定的局限性，有學(xué)者指出，篩選培養(yǎng)基在檢測A類酶（KPC）方面表現(xiàn)良好，CRE檢測限為101～102CFU/mL，而B類酶的檢測限為102～103CFU/mL[6]。因此，這2種方法更適合在以產(chǎn)A類酶CRE為主的醫(yī)院推廣。本研究中，有6例樣本藥物篩選法和紙片篩選法結(jié)果均為陽性，但PCR篩選法為陰性，考慮該CRE菌株可能存在其他耐藥機制，如產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶或頭孢菌素酶聯(lián)合膜孔蛋白缺失或突變等；還有1株產(chǎn)NDM-1+IMP-4酶的肺炎克雷伯菌，2種篩選培養(yǎng)基均顯示陰性。鑒于碳青霉烯酶及其他耐藥基因可以通過質(zhì)粒或整合子在腸桿菌科及非腸桿菌科菌株之間水平傳播，因此為了減少耐藥菌株的播散，仍建議將此類樣本列為CRE篩選陽性。

本研究尚有一定的局限性，在以糞便樣本中產(chǎn)B類NDM酶為主的兒童醫(yī)院開展，對于A類（KPC）酶的檢測結(jié)果代表性稍差。此外，還缺乏對產(chǎn)D類（OXA-48）酶CRE菌株的篩查檢測。有研究發(fā)現(xiàn)，使用基于培養(yǎng)的方法檢測產(chǎn)D類酶菌株較困難[19]，因為此類菌株通常對碳青霉烯類以及廣譜頭孢菌素類抗菌藥物有較低的最小抑菌濃度，因此主要依賴PCR技術(shù)來篩查[21]。有研究在對重癥監(jiān)護病房患者的直腸拭子采用實時熒光定量PCR技術(shù)篩查產(chǎn)OXA-48酶CRE時發(fā)現(xiàn)，整體敏感性和特異性分別高達95.7%和100.0%[22]。對于OXA-48酶流行的地區(qū)（如北非國家），Supercarba培養(yǎng)基對此類產(chǎn)酶菌株表現(xiàn)出較高的敏感性（80%）和特異性（98.5%）[23]。

后續(xù)我們將開展多中心臨床研究，以提高實驗結(jié)果的可靠性。針對紙片篩選法，在篩查臨床糞便樣本時可適當增大抑菌圈直徑，以最大限度地提高CRE的檢出率；針對藥物篩選法，ADLER等[18]發(fā)現(xiàn)，在以色列這樣的CRE高流行地區(qū)，采用含1 μg/mL亞胺培南的麥康凱瓊脂平板是檢測CRE攜帶者最合適的方法。后續(xù)我們還將探索篩查臨床糞便樣本最適合的抑菌圈直徑，進而評價含1 μg/mL亞胺培南的麥康凱瓊脂平板的檢測能力及臨床應(yīng)用價值。

CRE在世界范圍內(nèi)的傳播是公共衛(wèi)生安全的一個重大威脅，需要醫(yī)療機構(gòu)共同努力，確保迅速、準確地檢測并實施有效的感染控制戰(zhàn)略，這是防止醫(yī)院內(nèi)多重耐藥甚至廣泛耐藥細菌感染進一步發(fā)展的關(guān)鍵。藥物篩選法和紙片篩選法均可用于糞便樣本CRE菌株的篩查，可作為臨床常規(guī)篩查CRE攜帶者的有效方法。目前國際上對CRE篩查方法尚無統(tǒng)一標準，因此需要臨床微生物實驗室根據(jù)當?shù)氐腃RE流行病學(xué)、周轉(zhuǎn)時間要求，以及現(xiàn)有的資源確定最佳方法，并不斷探索完善，以最大程度提高篩查的準確性，有效控制感染播散。