胃復春膠囊提取物對5-氟尿嘧啶誘導人胃癌細胞凋亡的影響

潘海春 祁大慶 陳琳慧 汪玲羽

胃癌的特征是在胃壁內生長癌細胞，雖然與其他類型的癌癥相比，胃癌相對罕見，但這種疾病最大的危險因素之一是診斷困難。因為胃癌通常不會引起任何早期癥狀，所以通常在擴散到身體其他部位后才被確診，這使得治療更加困難[1]。中國胃癌每年新發病例約為68萬例，占全球發病病例的一半左右，且大部分患者診斷時已為進展期胃癌[2]。當上消化系統內正常健康的細胞發生癌變，生長失控形成腫瘤時，就會發生胃癌。這個過程發生得很慢，因此胃癌往往會發展多年[3]。有很多因素可能會增加患胃癌的風險，包括某些其他疾病，例如：淋巴瘤、幽門細菌感染、消化系統其他部位的腫瘤、胃息肉等[4]。晚期胃癌最常見的癥狀有：惡心嘔吐、頻繁的胃灼熱、食欲不振，有時伴有突然的體質量減輕、持續性腹脹、早飽、血便、黃疸、過度疲勞、胃痛等[5]。胃癌的主要治療方法有：化療、放射治療、外科手術、免疫治療、疫苗和藥物治療等[6]。5-氟尿嘧啶是嘧啶類的氟化物，屬于抗代謝、抗腫瘤藥，能有效抑制胸腺嘧啶核苷酸合成酶，阻斷脫氧嘧啶核苷酸轉換成胸腺嘧啶核苷酸，又能干擾DNA合成，同時也一定程度的抑制RNA。臨床常用于胃癌、肝癌、直腸癌、結腸癌等的治療[7, 8]。

細胞的凋亡與氧化應激密切相關，在正常情況下,機體內ROS的產生和ROS清除系統處于動態平衡狀態，其他外源和內源因素誘導時會平衡破壞，大量的活性氧來不及清除會產生細胞毒性而對人體產生傷害，有研究表明，活性氧的氧化應激也是胃癌凋亡的因素之一[9，10]。

胃復春膠囊是一種用于治療胃部疾病的中成藥，主要對惡心、嘔吐、反酸、噯氣、胃脹、胃痛、食欲不振等臨床癥狀有治療效果，臨床上可用于胃癌的輔助治療[11,12]。本研究通過細胞凋亡和抗氧化水平的檢測來研究胃復春膠囊提取物對5-氟尿嘧啶誘導的人胃癌細胞凋亡的促進作用的相關機制，研究胃復春膠囊的提取物在胃癌中細胞的氧化應激和凋亡的作用影響，從而為胃復春聯合抗癌藥物在胃癌的輔助治療提供依據。

1 材料和方法

1.1 儀器UV-3600Plus分光光度計(島津企業管理有限公司)；厭氧工作站 Concept 1000(北京隆福佳生物科技有限公司)；DYY-6D三恒電泳儀(北京市六一儀器廠)； BD FACSCanto II 流式細胞儀(上海碧迪醫療器械有限公司)；TSX40086A 超低溫冰箱(賽默飛世爾科技(中國)有限公司)；W5L-1恒溫水浴槽(杭州瑞誠儀器有限公司)；BSA224S電子天平(賽多利斯科學儀器(北京)有限公司)；MLS-3751L高壓蒸汽滅菌鍋(松下健康醫療器械株式會社)；Stab S2可疊加式全溫振蕩培養箱(上海潤度生物科技有限公司)Milli-Q超純水系統(美國Millipore公司)；Eppendorf-5424小型高速離心機(艾本德中國有限公司)。

1.2 試驗用藥品與試劑胃復春膠囊(國藥準字Z20090697，杭州胡慶余堂有限公司)；5-氟尿嘧啶、DMSO、注射用青霉素鈉及注射用硫酸鏈霉素(美國Sigma公司)；胎牛血清、DMEM(美國HyClone公司)；胰蛋白酶(美國Gibico公司)；胎牛血清(Invitrogen公司)；噻唑藍(MTT)試劑盒(北京索萊寶生物科技有限公司)；細胞漿蛋白抽提試劑盒(上海碧云天生物技術有限公司)；實驗所用抗體包括Bax、Bcl-2和GAPDH(均購買自美國Cell Signaling Technology公司)；AnnexinV/PI細胞凋亡檢測試劑盒(Bender公司)；細胞漿蛋白抽提試劑盒(上海碧云天生物技術有限公司)；蒸餾水由Milli-Q超純水系統制得；鹽酸、碳酸氫鈉、乙醚均為分析純(購自北京化工廠)；其他試劑(分析純)(北京試劑廠)。

1.3 方法

1.3.1 細胞株及培養人胃癌細胞株MGC-803購買自美國模式菌種收集中心(American Type Culture Collection, ATCC)。將胃癌細胞培養于PMI1640培養液(100 μg/ml鏈霉素、100 U/ml 青霉素、10%胎牛血清)中，置于37 ℃濕度飽和的細胞培養箱內(含5% CO2，95%空氣)，取對數生長期的細胞接種于24孔細胞培養板(5×105個/ml密度)中，每孔1 ml，置于培養箱(37 ℃、5%CO2)中恒溫培養。

1.3.2 抑制細胞增殖的實驗取MGC-803胃癌細胞(1×105/ml)分別接種于96孔板(200 μl/孔)，每孔加入終濃度為0、50、100、200 nmol/L的5-氟尿嘧啶或0、50、100、200 μg/ml的胃復春膠囊提取物。以同體積PMI1640培養液為空白對照。各質量濃度均設5個復孔，分別繼續培養24 h，吸去藥液，在37 ℃下每孔加入MTT試劑100 μl，繼續孵育4 h，用分光光度計在OD=590 nm處測定各孔吸光度值(A)?？瞻讓φ战M細胞的活力計為100%，計算各處理組細胞的相對活力(×100%)。以細胞活力下降到對照的50%時所對應的藥品濃度計為半抑制濃度(IC50)。

1.3.3 檢測細胞凋亡及細胞周期將MGC-803胃癌細胞(1×105/ml)接種于6孔培養板內，分別加入0、50、100、200 μg/ml的胃復春膠囊提取物和終濃度為50 nmol/L的5-氟尿嘧啶，細胞培養24 h后收集并離心，再加入Annexin V-FITC和碘化丙啶(PI)染色液，輕輕混勻，室溫避光反應15 min，篩網過濾后送流式細胞儀檢測細胞凋亡。另取各孔細胞，PBS洗滌2次，用冰浴預冷的70%乙醇于4 ℃固定24 h，PBS洗滌2次，加入PI染色液，避光染色30 min，使用流式細胞儀分析細胞周期。

1.3.4 Western blot檢測蛋白表達量的變化MGC-803細胞以50 nmol/L的5-氟尿嘧啶、100 μg/ml的胃復春膠囊提取物處理24 h后，收集細胞，參照試劑盒說明書進行細胞漿蛋白抽提操作，進行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，電轉至PVDF膜上，以GAPDH分別作為內參，然后ECL發光液顯色，觀察各條帶深淺變化。

1.3.5 細胞SOD MDA和GSH-Px測定50 nmol/L的5-氟尿嘧啶、100 μg/ml的胃復春膠囊提取物MGC-803細胞處理24 h后，按組別收取細胞培養上清液，按MDA、SOD、GSH-Px試劑盒說明書操作，測定細胞培養液上清中的MDA、SOD、GSH-Px含量。

2 結果

2.1 5-氟尿嘧啶及胃復春膠囊提取物對胃癌細胞活力的影響不同濃度的5-氟尿嘧啶處理細胞24 h后，MGC-803細胞株活力顯著降低，并具有濃度依賴性，其中50 nmol/L的5-氟尿嘧啶處理后，細胞活力大約下降了50%，其半抑制濃度為51.25 nmol/L。見表1。經過50 nmol/L的5-氟尿嘧啶和不同濃度胃復春膠囊提取物共同處理24 h、48 h、72 h后，MGC-803細胞株活力均有所下降，且隨著胃復春膠囊提取物濃度的升高和處理時間的增加，同步對細胞活力的下降作用也逐漸增強，呈濃度和時間依賴效應。見表2。

表1 5-氟尿嘧啶對MGC-803細胞活力的影響

表2 胃復春膠囊提取物對5-氟尿嘧啶處理的胃癌細胞活力的影響

2.2 胃復春膠囊提取物對5-氟尿嘧啶誘導的胃癌細胞凋亡的促進作用流式細胞儀檢測結果顯示，胃復春膠囊提取物能抑制胃癌細胞凋亡。胃復春膠囊提取物(終濃度為100μg/ml)處理胃癌細胞24 h后，細胞凋亡率(早期凋亡+晚期凋亡)為23.70%，5-氟尿嘧啶(50 nmol/L)處理的細胞凋亡率為20.33%。5-氟尿嘧啶和胃復春膠囊提取物共同處理的細胞，細胞凋亡率顯著增加，達到43.02%，明顯高于5-氟尿嘧啶單獨處理組。見圖1。

圖1 胃復春膠囊提取物對5-氟尿嘧啶誘導的細胞凋亡的促進作用

2.3 5-氟尿嘧啶及胃復春膠囊提取物對胃癌細胞內與細胞凋亡相關的蛋白表達量的影響通過Western blot測定發現，經過5-氟尿嘧啶處理后MGC-803細胞中，cleaved caspase-3、cleaved caspase-9表達量上調；在胃復春膠囊與5-氟尿嘧啶組，胃癌細胞中cleaved caspase-3、cleaved caspase-9表達量隨著劑量增加持續上調。見圖2。

圖2 胃復春膠囊提取物及5-氟尿嘧啶聯用對與細胞凋亡相關蛋白表達量的影響

2.4 5-氟尿嘧啶及胃復春膠囊提取物對胃癌細胞中SOD MDA和GSH-Px的影響與對照組培養細胞上清液比較，采用黃嘌呤氧化酶法于550 nm處對SOD活力的測定結果顯示，5-氟尿嘧啶處理使胃癌細胞中SOD酶活性有所降低(P>0.05)，胃復春膠囊提取物與5-氟尿嘧啶聯用處理組胃癌細胞SOD酶活性降低比較明顯(P<0.05)；采用TBA法(532 nm)測定MDA含量的結果顯示：5-氟尿嘧啶處理使胃癌細胞中MDA含量明顯升高，胃復春膠囊提取物與5-氟尿嘧啶聯用處理組MDA含量明顯升高(P<0.05)；5-氟尿嘧啶處理使胃癌細胞中GSH-Px活性顯著降低，而胃復春膠囊提取物與5-氟尿嘧啶聯用處理后細胞上清液中GSH-Px活性進一步降低(P<0.05)。見表3。

表3 胃復春膠囊提取物及5-氟尿嘧啶聯用對胃癌細胞中SOD MDA和GSH-Px的影響 (n=5)

3 討論

腹部腫瘤可能是一個嚴重的威脅生命的問題。事實上，胃癌是最致命的癌癥之一，這主要是因為直到疾病發展到相當嚴重時才出現明顯的癥狀。目前，手術、化療和放療是胃癌最常見的治療方法。胃癌手術可能需要切除全部或部分胃，附近的淋巴結也可能需要切除。切除部分胃的手術可能會緩解晚期胃癌患者的癌癥癥狀和體征?；熓且环N利用化學物質殺死癌細胞的藥物治療?；熕幬锉椴既恚瑲⑺揽赡軘U散到胃以外的癌細胞[13]。5-氟尿嘧啶雖然臨床應用很多，但是也有大量的不良作用，例如：胃腸道反應經常會出現腹痛、惡心嘔吐、食欲不振等癥狀，嚴重者有血性腹瀉或便血。此外還有骨髓抑制、脫發、皮膚和指甲色素沉著等[14]。與化療藥物相比，天然產物在胃癌的治療中具有安全性高、不良作用小的優點。目前已報道了多種具抗腫瘤作用的天然產物對胃癌的作用，包括在體外對胃癌細胞系的研究或在體內對胃癌動物模型的研究，也有少量的臨床試驗[15]。許多天然化合物可以通過誘導細胞周期阻滯或誘導胃癌細胞凋亡而抑制胃癌生長。天然物質的另一用途是聯合療法，即2種或2種以上的物質或一種天然產物與常規化療藥物聯合用藥。一些天然化合物可能對傳統的細胞毒療法敏感，增強藥物的有效濃度，增強2種藥物的聯合作用或對腫瘤細胞產生特異性的細胞毒作用。此外，通過靶向多種信號通路的聯合治療，利用各種機制來減少抗腫瘤藥物的耐藥性[16]。胃復春是中藥復方制劑，臨床上主要用于防治慢性萎縮性胃炎及胃癌前病變，已有多年應用的歷史。但是胃復春治療胃癌癌前病變的作用機制尚不明確。

細胞凋亡(Apoptosis)是以核DNA斷裂為標志的細胞自我毀滅的遺傳導向過程，通過刺激物的存在或抑制劑或刺激物的去除而被激活，是消除DNA受損、多余或不需要的細胞的正常生理過程，當停止(如基因突變)可能導致細胞異形增生和腫瘤形成，故又稱為程序性細胞死亡(PCD)，細胞凋亡是人體的本身具有的生理機制，在人體內環境的穩定中發揮重要作用[17,18]。本研究發現5-氟尿嘧啶可引起MGC-803細胞凋亡，而不同濃度的胃復春膠囊提取物可以促進由5-氟尿嘧啶誘導引起的細胞凋亡，表明胃復春膠囊提取物與5-氟尿嘧啶聯用，可以促進5-氟尿嘧啶致凋亡的作用。

據報道在細胞凋亡過程中Bcl-2家族蛋白的激活也起到重要作用[19]。胃復春膠囊提取物與5-氟尿嘧啶聯用處理的MGC-803細胞中可以進一步上調Bax的表達量，下調Bcl-2的表達量。猜測可能是通過調節Bcl-2家族蛋白活性從而促進細胞凋亡。有文獻表明機體內氧化應激(Oxidative stress)是ROS的產生和清除處在失衡狀態的表現[20]。此次研究中發現胃復春膠囊提取物增強氧化應激水平，對5-氟尿嘧啶處理的胃癌細胞的促進凋亡作用可能與它的氧化還原功能有關。

綜上所述，在5-氟尿嘧啶處理的胃癌細胞中，胃復春膠囊的提取物可以對抗凋亡蛋白的表達進行抑制，對促凋亡蛋白分子進行增強，同時促進胃癌細胞的凋亡。此次研究的結果對胃復春膠囊進一步研究對胃癌術后的輔助作用提供理論依據。