Elabela 通過α7nAChR/JAK2/STAT3 信號通路改善心肌缺血/ 再灌注損傷的機制研究

杜勝利 張大鵬 賈增芹

AMI 后心肌缺血/再灌注（MI/R）損傷可誘導更多的氧自由基產生，最終導致心肌細胞凋亡，甚至死亡。因此，抑制氧化應激和細胞凋亡將有助于MI/R 損傷的治療。目前尚無有效的藥物或操作方法治療MI/R。Wang（2015 年）等認為，小分子肽Elabela 及其配體APJ 信號通路與心血管病理生理密切相關，其主要在心臟血管的內皮細胞中表達。Elabela對心臟胚胎發生至關重要。Chng（2013年）、Pauli（2014 年），Peverelli（2014 年）等 相繼發現，缺乏Elabela 的魚類會出現嚴重的心臟發育不良，甚至缺如。同時他們也發現，Elabela 可以通過引導血管細胞遷移到中線，改變細胞內鈣穩態，以及激活磷酸化Smad3 等途徑來促進血管生成。Elabela/APJ 還可引起冠狀動脈擴張，增強心肌收縮力，改善左心室肥厚和心肌間質纖維化以及抗高血壓作用。但是，到目前為止，Elabela 對MI/R 的影響尚不清楚。人類中樞神經系統通過從迷走神經末端釋放乙酰膽堿并激活炎癥細胞中的α7 煙堿型乙酰膽堿受體（α7nAChR）來阻斷促炎分子的產生。Pavlov 等（2003 年）認為α7nAChR 是一種配體門控離子通道，其主要作用是轉運神經系統中的乙酰膽堿。當其與乙酰膽堿結合時，α7nAChR 的抗炎信號傳導至細胞質，激活Janus 激酶2 /信號轉導子和轉錄激活子3（JAK2/STAT3）信號通路，啟動抗炎轉錄。因此，迷走神經可能通過乙酰膽堿/α7nAChR 抑制炎癥、細胞凋亡、氧化應激和促進血管生成來治療心血管疾病。在本研究中，筆者評估了Elabela 對H9C2 細胞凋亡和氧化應激的影響及其潛在的機制，現報道如下。

對象與方法

一、研究對象

筆者連續招募了北京佑安醫院26 例ST 段抬高型心肌梗死患者（STEMI 組）和同期的26 名健康受試者作為對照（對照組）。所有心肌梗死患者均為首次發生心肌梗死，并在癥狀出現后12 h 內住院治療。STEMI 在入院時診斷需符合以下標準，包括臨床癥狀、典型心電圖表現、心肌肌鈣蛋白-Ⅰ（cTnⅠ）和CK-MB 含量增加以及冠狀動脈造影的結果。對照組則定義為冠狀動脈無明顯有意義的狹窄（狹窄< 50%）。排除標準：年齡< 18 歲或 > 80 歲、心肌病、感染性疾病、活動性炎癥疾病、血液系統疾病、腫瘤晚期、嚴重肝腎功能不全且拒絕進入研究者。筆者通過電子醫囑系統獲得受試者的人口統計學信息。所有受試者在入院后24 h 內采集靜脈血以檢測血漿Elabela 水平。使用Elabela（人）試劑盒（美國半島實驗室，貨號：S-1508）對Elabela 的血漿濃度進行定量檢測，操作按試劑盒說明進行。本研究獲取了首都醫科大學附屬北京佑安醫院倫理委員會的批準（LL-2021-004-Y），所有受試者均簽署了書面知情同意書。

二、主要試劑和抗體

DMEM/F12培養基（DMEM，產品編號sh30023.01b）和胎牛血清（產品編號sv30087.03）購自美國Hyclone 公司，過氧化氫（HO，產品編號RJ0523）購自德國Bioruler，乳酸脫氫酶（LDH）、超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）檢測試劑盒均購自南京建成生物工程研究所，細胞計數試劑-8（CCK-8 試劑盒，產品編號C0038）、熒光探針二氫乙錠（DHE）均購自Beyotime 公司（中國江蘇），Bcl-2、Bax、GAPDH 抗體均購自ProteinTech 公司（美國芝加哥），α7nAChR 抗體購自英國劍橋Abcam 公司，p-JAK2、t-JAK2、p-STAT3、t-STAT3 抗體購自Cell Signaling Technology公司（美國馬薩諸塞州），凋亡檢測試劑盒購自Becton， Dickinson and Company（美 國 紐 約BD 公司），ELA-32（人，是Elabela 經剪切后的一個成熟肽，含32 個氨基酸）（產品編號6291/100U）、Quantinova Rev 轉錄試劑盒（產品編號205411）、Quantinova SYBR PCR 試劑盒（產品編號208054）和RNeasy 迷你試劑盒（產品編號74104）購自德國Qiagen 公司。

三、細胞培養和處理

大鼠心肌細胞H9C2（大鼠胚胎心臟克隆細胞系，產品編號：JNO-19363-1）購自中國廣州吉妮歐生物科技有限公司。細胞培養基由10%（V/V）胎牛血清、100 U/mL 青霉素/鏈霉素和DMEM 組成。細胞在培養皿中培養，然后接種在6 孔板中，用ELA-32 和（或）α-銀環蛇毒素（α-BTX，Sigma）預處理30 min （HO+ ELA-32 組和HO+ELA-32 + α-BTX 組）。向細胞培養基中添加HO（最終濃度為400 μmol/L）2 h（HO組），收集H9C2 或上清液進行后續分析。

四、細胞活力測定

H9C2（6×10個細胞/mL）在對數期時接種在96 孔板上，根據試劑盒的說明，使用CCK-8 分析方法評估H9C2 的細胞活力。

五、LDH、SOD 和MDA 試驗

使用LDH 檢測試劑盒檢測細胞上清液中的LDH 濃度。使用SOD、MDA 試劑盒檢測培養基中SOD、MDA 的活性。

六、細胞凋亡檢測

使用Annexin V 異硫氰酸熒光素（FITC）/碘化丙啶（PI）試劑盒在BD 流式細胞儀上檢測細胞凋亡水平，使用FlowJo VX 軟件對細胞凋亡率進行量化。

七、DHE 染色

使用組織活性氧（ROS）檢測試劑盒（DHE）處理細胞后在熒光顯微鏡下直接觀察，利用ImageJ軟件量化細胞內ROS 的水平。

八、蛋白免疫印跡法

蛋白經提取、變性、電泳、電轉后，將Bax、Bcl-2、α7nAChR、p-JAK2、t-JAK2、p-STAT3、t-STAT3 和內參GAPDH 的抗體（稀釋比例為1∶1000）培養過夜，清洗后再將抗兔二抗添加到膜上，然后用Licor 系統掃描。根據蛋白免疫印跡條帶的光密度測定蛋白表達。

九、實時熒光定量（RT）-qPCR

通過RNeasy 試劑盒從H9C2 細胞中提取總RNA，通過轉錄試劑盒從RNA 中反轉錄產生cDNA。用SYBRGreen PCR 混合物（Thermo Fisher Scientific，Inc.）在ABI 7500 熱循環上運行RT-qPCR法用于量化最終結果。本研究中使用的引物為：Elabela 正向5′-GCGAGTCTCTCTCTCTTTTATCAGG-3′和反向5′-ATCTCCGGCGAAAGAGAGTTG-3′，GAPDH 正向5′-TGATTCTACCCACGGCAAGTT-3′ 和 反 向5′-TGATGGGTTTCCCATTGATGA-3′。

十、統計學處理

結 果

一、STEMI 受試者血漿中的Elabela 水平增加

對照組和STEMI 組的性別、年齡、高血壓、糖尿病、吸煙、血脂、腎功能等比較差異均無統計學意義（P 均> 0.05），見表1；STEMI 組的Elabela 水平高于對照組（P < 0.001），見圖1。

表1 對照組和STEMI 組基線資料比較

二、H2O2 處理后Elabela 表達增加

用RT-qPCR 評 估HO處 理 后Elabela 的 表達，結果表明經HO處理上調了Elabela 表達水平（2：1.007 vs. 5.640，t = 40.883，P < 0.001）。

三、ELA-32 預處理增強H9C2 細胞活力

與對照組相比，使用200 nmol/L 和500 nmol/L ELA-32 預處理增加了H9C2 細胞活力，2 組比較差異有統計學意義（F = 21.029，P < 0.001），而在200 nmol/L 和500 nmol/L 組間細胞活力比較差異無統計學意義（F = 21.029，P = 0.570）（圖1）。因此，后續實驗決定使用200 nmol/L ELA-32 進行30 min 的預處理。

圖1 不同濃度Elabela 對H9C2 細胞活力的影響

四、ELA-32 預處理保護H9C2 細胞免受H2O2誘導的細胞損傷

LDH 的釋放水平反映了細胞損傷的程度。HO可以明顯增加H9C2 細胞的LDH 釋放水平［（38.6±1.14）U/L vs. （83.6±5.22）U/L，P<0.001］，而ELA-32 預處理可以逆轉這種有害作用［（83.6±5.22）U/L vs.（62.2±12.39）U/L，P=0.001，F = 41.688，P < 0.001，n = 5］。

五、ELA-32 預處理減少H2O2 誘導的氧化應激損傷

與對照組相比，HO組ROS 陽性細胞數量明顯增加（F = 800.457，P < 0.001），但在ELA-32處理后ROS 陽性細胞數則減少（F = 800.457，P <0.001） （圖2A、B）。此外，經HO處理H9C2 細胞 后，SOD 水 平 降 低（F = 10.929，P < 0.001），MDA 水平升高（F = 7.089，P = 0.001），而ELA-32 的預處理逆轉了這種有害效應，差異均有統計學意義（SOD、MDA 分別為P = 0.001、P = 0.045）（圖2C、D）。這些結果均表明，ELA-32 可能抑制HO誘導的ROS 生成，減少H9C2 細胞損傷。

圖2 Elabela 對細胞氧化應激水平的影響

六、ELA-32 減少H2O2 誘導的H9C2 細胞凋亡

用HO處理的H9C2 凋亡率明顯上升。但與HO處理的細胞相比，ELA-32 可以降低細胞的凋亡水平（圖3A、B，F = 360.182，P < 0.001）。與HO組相比，HO+ ELA-32 組的Bax/Bcl-2 降低，差異有統計學意義（圖3C、D，F = 85.180，P <0.001），提示ELA-32 可以減少HO損傷引起的細胞凋亡。

圖3 Elabela 對細胞凋亡的影響

七、ELA-32 對α7nAChR/JAK2/STAT3 通路的影響

為探索ELA-32 是如何保護H9C2 細胞的，研究對H9C2細胞中α7nAChR、p-JAK2、JAK2、p-STAT3和STAT3 的水平進行定量研究。結果發現，與對照組相比，在HO處理后的α7nAChR、 p-JAK2和p-STAT3 的蛋白質水平表達降低，而ELA-32預處理組的α7nAChR、p-JAK2、p-STAT3 表達水平升高，差異均有統計學意義（圖4A～D，P 均<0.05）， 表 明ELA-32 可 以 影 響α7nAChR/JAK2/STAT3 信號通路中關鍵蛋白質的表達。

圖4 Elabela 影響α7nAChR/JAK2/STAT3 信號通路蛋白表達

八、ELA-32 通 過α7nAChR 介 導 的JAK2/STAT3 途徑抑制H2O2 誘導的H9C2 細胞損傷

在HO處理的H9C2 細胞中，與單獨給予ELA-32 相比，ELA-32+α-BTX 處理增加了細胞凋亡率和ROS 陽性細胞的數量，差異均有統計學意義（圖5A～D，P 均< 0.05）。此外，與ELA-32 組相比，α-BTX 的應用逆轉了Elabela 帶來的MDA的降低和SOD 的升高（圖5E、F，P < 0.05）。因此，ELA-32 可能部分通過激活α7nAChR/JAK2/STAT3 途徑發揮心肌細胞保護作用（圖6）。

圖5 Elabela 通過α7nAChR/JAK2/STAT3 信號通路發揮心肌保護的作用

圖6 Elabela 的作用和機制簡圖

討 論

MI/R 是AMI 后死亡的重要原因之一。MI/R是一種由炎癥、細胞凋亡和氧化應激等復雜因素引起的心肌損傷。研究發現，Elabela 可通過抑制缺氧/復氧（H/R）或MI/R 誘導的轉化生長因子-β（TGF-β）增加，保護腎臟免受MI/R 損傷。但是Elabela 能否減輕MI/R 損傷尚不清楚。本研究發現ELA-32 可以降低HO誘導的H9C2 細胞凋亡率，降低心肌細胞凋亡相關蛋白Bax 的產生、心肌細胞凋亡率、ROS 陽性細胞數、LDH 水平和MDA 水平；增加SOD 活性和Bcl-2 表達，從而發揮心肌細胞的保護作用。此外，筆者還發現ELA-32 可能部分通過激活α7nAChR/JAK2/STAT3 信號通路起到上述有益的作用。

目前，關于Elabela 在心肌缺血中作用的研究都是基于動物模型。Perjés 等發現，動物研究中的假手術組的Elabela 表達明顯低于心肌缺血組。本研究同樣發現，對照組的血漿Elabela 濃度明顯低于STEMI 組。

LDH 是一種廣泛應用的心肌損傷標志物。諸多研究發現，MI/R 時LDH 釋放水平明顯增加。因此，筆者檢測了LDH 活性和細胞活力，用于評估心肌損傷的范圍。結果表明，ELA-32 預處理改善了HO誘導的H9C2 細胞LDH 活性升高和細胞活力降低，表明ELA-32 對HO誘導的細胞損傷具有保護作用。Manzanero（2013 年）等發現，氧自由基在MI/R 條件下能夠大量產生。MI/R 的主要原因是通過有氧代謝產生的ROS。Valko（2007年）等認為，ROS 是不穩定的化合物，很容易與蛋白質、DNA 反應，并誘導細胞凋亡，甚至死亡。因此，減輕氧化應激和減少氧化產物可能是治療MI/R 的一種途徑。在本研究中，筆者用DHE 染色陽性細胞的數量、MDA 和SOD 來反映H9C2 細胞中的氧化和抗氧化水平。結果發現，經過HO處理明顯降低SOD 水平，增加MDA 水平和DHE 陽性細胞，而用ELA-32 預處理則可明顯逆轉HO帶來的上述指標的變化。在MI/R 過程中，細胞凋亡在細胞死亡中起著至關重要的作用。最終會導致心功能不全，甚至死亡。因此，降低心肌細胞的凋亡率已成為治療MI/R 損傷的有效方法之一。在本研究中，筆者檢測了Elabela 對細胞凋亡的影響。結果表明，ELA-32 預處理明顯降低了Bax 水平和Bax/Bcl-2 值以及H9C2 細胞凋亡率。因此，筆者得出結論，ELA-32 預處理可能通過阻斷細胞凋亡途徑減輕HO損傷。

研究表明，刺激迷走神經和α7nAChR / JAK2激活可降低MI/R 模型大鼠的炎癥水平、惡性心律失常和死亡的發生率，并抑制血液中的氧自由基濃度和左心室重塑。在本研究中發現，ELA-32明 顯 增 加 了α7nAChR、p-JAK2 和p-STAT3 的 表達。α7nAChR 拮抗劑α-BTX 可阻斷ELA-32 對心肌細胞的保護作用。因此，本研究證明α7nAChR/JAK2/STAT3 信號通路可能參與了Elabela 對HO誘導的心臟損傷的保護作用。

本研究還存在一些不足。臨床研究上，缺乏關于缺血持續時間、缺血區域范圍、冠狀動脈疾病程度（1～3 支血管疾?。┑男畔?，也沒有動態觀察血漿Elabela 的濃度變化，基礎研究中也缺乏動物實驗，將來有必要進一步擴大樣本量，完善體內實驗，進一步探索Elabela 調節α7nAChR 的具體過程。

ELA-32 預處理至少部分通過α7nAChR/JAK2/STAT3 信號通路對HO誘導的心臟損傷發揮保護作用。Elabela 可能成為改善MI/R 損傷的有效藥物。