基于UHPLC-Q-Orbitrap HRMS和生物信息學探討瓜蔞薤白湯治療冠心病的潛在藥效物質基礎和作用機制

孫 志，張媛媛，周勝楠，劉麗偉，包曉悅，程文播，李小強，王 靖，左莉華

基于UHPLC-Q-Orbitrap HRMS和生物信息學探討瓜蔞薤白湯治療冠心病的潛在藥效物質基礎和作用機制

孫 志1, 2，張媛媛1, 2，周勝楠1, 2，劉麗偉1, 2，包曉悅1, 2，程文播3，李小強3，王 靖1, 2，左莉華1, 2

1. 鄭州大學第一附屬醫院 藥學部，河南 鄭州 450052 2. 河南省精準醫學臨床質譜工程研究中心，河南 鄭州 450052 3. 中國科學院蘇州生物醫學工程技術研究所，江蘇 蘇州 215163

系統分析并識別瓜蔞薤白湯主要化學成分和入血成分，預測其防治冠心病的藥效物質基礎和作用機制。采用超高效液相色譜-四級桿/靜電場軌道阱高分辨質譜（UHPLC-Q-Orbitrap HRMS）進行瓜蔞薤白湯體內外成分分析，結合色譜峰保留時間、精確相對分子質量、碎片離子、中性丟失等信息進行化合物指認。使用生物信息學方法，對潛在靶點進行GO和KEGG富集分析，借助Cytoscape軟件構建瓜蔞薤白湯“活性成分-核心靶點-通路”網絡圖，對潛在活性成分和作用通路進行預測。利用AutoDock Tools 1.5.6軟件對其活性成分與核心靶點進行分子對接驗證。瓜蔞薤白湯體外定性得到了68個化學成分，大鼠ig給藥后在血清樣本中檢測到23個入血成分。其中芹菜素、木犀草素、酒渣堿、亞油酸等化合物為瓜蔞薤白湯發揮治療冠心病藥效的關鍵成分，前列腺素內過氧化物合成酶2（prostaglandin-endoperoxidesynthase 2，PTGS2）、腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）、基質金屬蛋白酶-9（matrix metalloproteinase-9，MMP-9）、表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）、半胱氨酸蛋白水解酶3（cysteine-containing aspartate-specific protease 3，CASP3）等為瓜蔞薤白湯治療冠心病的主要靶點，涉及到脂質與動脈粥樣硬化、癌癥的途徑、TNF信號通路、NF?κB信號通路、MAPK信號通路。初步鑒定了瓜蔞薤白湯防治冠心病的潛在藥效成分并預測其作用靶點，為該方藥效物質基礎及作用機制的深入研究提供參考。

瓜蔞薤白湯；UHPLC-Q-Orbitrap HRMS；入血成分；網絡藥理學；分子對接；芹菜素；木犀草素；酒渣堿

冠心病（coronary heart disease，CHD）是一種與人體多系統相關的慢性復雜疾病，已成為世界范圍內的主要死亡原因之一[1]，尋求安全有效的治療方法改善冠心病的癥狀十分必要。中藥復方在我國臨床實踐了數千年，體現了“辨證論治”的治療原則，對維持中國人民的健康起著至關重要的作用。瓜蔞薤白湯源自張仲景的《金匱要略·胸痹心痛短氣病脈證治》[2]，具有通心陽、散瘀滯、止痹痛的功效[3]，與現代醫學的冠心病心絞痛、冠脈痙攣、心律失常、心肌梗死等癥狀一致。瓜蔞薤白湯由瓜蔞、薤白、白酒煎煮而成，現代藥理學研究表明，瓜蔞薤白湯具有多種生物活性，如心肌保護[4]、抗氧化[5]、抗炎[6]、干預慢性阻塞性肺病[7]等。盡管瓜蔞薤白湯已有廣泛的臨床應用和大量的藥理學研究，但關于其有效化學成分的數據并不充足，也尚未深入探索其治療冠心病的具體作用機制。

超高效液相色譜-四級桿-靜電場軌道阱高分辨質譜技術具有高分離能力、高準確性、高分辨率、低基質效應等特點，已逐步成為中藥藥效成分快速準確鑒定的重要手段[8]。藥物成分只有經消化道吸收入血到達靶器官或靶點才能在體內發揮相應的藥效[9]，因此挖掘藥物入血成分對于明確藥效成分、闡明藥效物質基礎具有重大的意義。生物信息學整體性、系統性的特點與中醫藥整體觀、辯證論治原則相符，已被廣泛用于中藥復方協同作用的研究中。基于此，本研究采用UHPLC-Q-Orbitrap HRMS技術對瓜蔞薤白湯化學成分、入血成分進行鑒定，選擇入血成分進行網絡藥理學分析，構建“活性成分-核心靶點-通路”網絡圖，探討其藥效物質基礎和潛在作用機制，為其臨床應用提供科學依據。

1 材料

1.1 儀器

Ultimate 3000超高效液相色譜儀（美國Dionex公司）；Q-Exactive質譜儀（美國Thermo Scientific公司）；ACQUITY UPLC?HSS C18柱（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）；萬分之一分析天平（瑞士Mettler Toledo公司）；Heraeus Fresco 17 Centrifuge型微量冷凍離心機（美國Thermo Scientific公司）；BX7200HP型超聲波清洗器（上海CIMO醫療器械制造有限公司）；N-1300旋轉蒸發儀（上海愛朗儀器有限公司）。

1.2 藥材與試劑

瓜蔞、薤白購于張仲景大藥房，經河南中醫藥大學中藥學教授李寒冰鑒定分別為葫蘆科植物栝樓Maxim的成熟果實、百合科植物小根蒜Bge.的干燥鱗莖。

對照品蘆丁（批號MUST-1603181）、木犀草苷（批號MUST-15012204）、木犀草素（批號MUST-21072311）、芹菜素（批號MUST-16061301）、5-羥甲基糠醛（批號MUST-16031202），均購于成都曼思特生物有限公司，質量分數均≥98%。精氨酸（批號11009，質量分數≥99.5%），纈氨酸（批號94619，質量分數≥99.5%），色氨酸（T0254，質量分數≥98%），均購自美國Sigma公司。白酒購自張仲景大藥房，甲醇、乙腈均為質譜級，購自美國Thermo Fisher公司。

1.3 動物

雄性SD大鼠12只，體質量（210～250 g）購自濟南朋悅實驗動物繁育有限公司，生產許可證號SCXK（魯）20190003。實驗前在12 h晝夜循環的動物房內適應性喂養7 d，自由獲取飼料和飲用水。動物實驗由河南省實驗動物中心實驗動物倫理委員會審查并批準（批件號ZZU-LAC20220225[13]）

1.4 數據庫與軟件

SwissTargetPrediction（http://www.swisstarget prediction.ch/），人類基因數據庫（GeneCards, https:// www.genecards.org/），人類孟德爾遺傳數據庫（OMIM，https://www.omim.org/），DrugBank數據庫（https://go.drugbank.com/），DisGeNET數據庫（https://www.disgenet.org/），STRING數據庫（https:// string db.org/），Metascape數據庫（http://metascape.org/），蛋白數據庫RCSB PDB（https://www.rcsb.org/），微生信（http://www.bioinformatics.com.cn/）。Thermo Xcalibur 3.0軟件，Mass Frontier 7.0軟件，Cytoscape 3.7.2軟件，AutoDock Tools 1.5.6軟件，PyMOL 2.4.1軟件。

2 方法

2.1 體內外成分分析

2.1.1 供試品溶液的制備 取瓜蔞30 g、薤白15 g與1400 mL白酒共煎，武火煎沸后轉文火煎煮90 min，濾過藥渣后得到約450 mL（含生藥量0.1 g/mL）瓜蔞薤白湯。取適量上述湯劑，3500 r/min離心10 min，取上清液，過0.22 μm微孔濾膜，即得瓜蔞薤白湯體外定性供試品溶液。取適量上述所得瓜蔞薤白湯，置于旋轉蒸發儀，濃縮20倍，得到生藥量為2 g/mL大鼠ig液。

2.1.2 對照品溶液的制備 精密稱定各對照品1.0 mg，分別置于10 mL量瓶中，甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，制備成質量濃度為0.1 mg/mL的單一對照品儲備液；分別精密移取上述儲備液適量，加甲醇稀釋，最終得到質量濃度為1 μg/mL的混合對照品溶液。

2.1.3 動物分組、給藥及樣本處理 12只大鼠隨機分為對照組和瓜蔞薤白湯給藥組，適應性飼養1周。給藥前12 h大鼠禁食不禁水。按10 mL/kg ig 給藥，對照組給予等體積的生理鹽水。于給藥后0.5、1、2、3、4 h，采用眼眶取血的方式各取1 mL于含有肝素鈉的EP管中，靜置約1 h，4 ℃、3500 r/min離心10 min，取上清液，空白組血漿處理方法與給藥組一致。取不同采血點上清各100 μL，渦旋30 s，加3倍量乙腈，渦旋3 min，4 ℃、13 000 r/min離心10 min，取200 μL進樣。

2.1.4 液質聯用條件 色譜條件：ACQUITY UPLC?HSS C18柱（100 mm×2.1 mm，1.8 μm），柱溫40 ℃，體積流量0.2 mL/min，進樣量5 μL。流動相為0.1%甲酸水溶液（A）-乙腈（B），瓜蔞薤白湯體外成分鑒定含藥血清成分鑒定試驗梯度洗脫程序為：0～4.0 min，5%B；4.0～51.0 min，5%～100%B；51.0～56.0 min，100%B；56.0～56.2 min，100%～5%B。

質譜條件：ESI電離源，正、負離子模式分開掃描。離子傳輸管溫度320 ℃，輔助氣溫度為300 ℃，鞘氣、輔助氣的體積流量分別為45、15 μL/min；碰撞能梯度為20、40、60 eV，質荷比窗口寬度設置為2，質量掃描范圍/80～1200。

2.1.5 瓜蔞薤白湯體內外代謝產物鑒定 根據“2.1.4”項下的色譜、質譜條件進樣，結合色譜峰保留時間、精確相對分子質量、碎片離子、中性丟失等信息進行瓜蔞薤白湯化學成分體外定性。給藥組和空白組樣本進行對比分析，提取2組間差異質譜峰，并結合保留時間、加荷離子信息和離子碎片，進行瓜蔞薤白湯體內入血成分鑒定。

2.2 生物信息學研究

2.2.1 入血成分靶點搜集 在PubChem數據庫中下載23個入血成分的2D結構，導入SwissADME網站進行篩選，標準為Pharmacokinetics項目中GI absorption為“High”，Druglikeness項中滿足2個指標為“Yes”，通過篩選的化合物在SwissTarget Prediction數據庫進行靶點預測。

2.2.2 冠心病相關靶點的篩選 基于GeneCards、OMIM、DrugBank和DisGeNET數據庫，以“coronary heart disease，CHD”為關鍵詞，獲取冠心病相關的疾病靶點。

2.2.3 “藥物-活性成分-靶點-疾病”網絡的構建 將上述得到的藥物靶點和疾病靶點各自刪除重復后，求交集得到瓜蔞薤白湯和冠心病共同作用的靶點。將瓜蔞薤白湯的活性成分、冠心病，交集基因分別歸類于“Drug”“Disease”“Gene”，建立Network和Type文件，導入Cytoscape 3.7.2軟件構建“藥物-成分-靶點-疾病”網絡。

2.2.4 蛋白質互作網絡（protein-protein interaction network，PPI）的構建 將上述得到的共有靶點導入STRING數據庫構建PPI網絡，蛋白種屬為“homo sapiens”，置信度為0.4，其他參數不變，得到蛋白相互作用關系的網絡圖，下載TSV格式。將該TSV文件導入到Cytoscape 3.7.2軟件，并使用cytoHubba插件進行拓撲分析，獲得瓜蔞薤白湯治療冠心病的關鍵靶點。

2.2.5 基因本體論（gene ontology，GO）與京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）富集分析 將瓜蔞薤白湯治療冠心病的相關靶點上傳到Metascape平臺中進行GO和KEGG富集分析，設定參考值＜0.05、富集因子＞1.5、最小計數值為3。最后在微生信網站進行GO和KEGG富集分析可視化。

2.2.6 “成分-靶點-通路”網絡的構建 將瓜蔞薤白湯活性成分、治療冠心病的關鍵靶點、KEGG富集通路分別歸類為“Drug”“Gene”“Pathway”，建立Network和Type文件，導入Cytoscape 3.7.2軟件，構建“成分-靶點-通路”網絡。

2.3 分子對接驗證

根據“成分-靶點-通路”網絡圖篩選degree值較高的靶點，從PDB數據庫下載該蛋白靶點的3D晶體結構pdb文件。根據“藥物-活性成分-靶點-疾病”網絡篩選關鍵活性成分，從PubChem數據庫中下載活性成分對應的SDF文件。通過Chem 3D軟件將2D結構優化并保存為3D結構的mol2格式。在AutoDockTools 1.5.6使用Vina軟件進行分子對接，最后使用Pymol軟件進行分子可視化。

3 結果與分析

3.1 體內外成分鑒定結果

3.1.1 體外化學成分鑒定 瓜蔞薤白湯正、負離子模式下的總離子流圖如圖1所示。共鑒定出68種化學成分，8種成分經對照品比對，詳見表1。包括黃酮類6個、氨基酸類10個、有機酸14個、核苷類4個、生物堿及含氮類11個、皂苷類6個、揮發油3個、糖類6個、其他類8個。

圖1 瓜蔞薤白湯在正離子模式(A) 和負離子模式(B) 下的總離子流圖

表1 瓜蔞薤白湯68個化學成分質譜信息

Table 1 Mass spectrum information of 68 chemical components of Gualouxiebai Decoction

編號成分名稱分子式tR/min離子模式理論值實測值誤差(×10?6)二級離子碎片來源 F1*蘆丁C27H30O1620.27[M＋H]+611.160 66611.159 85?1.33465.10, 303.05, 285.04, 153.01GL F2*木犀草苷C21H20O1121.57[M－H]?447.093 28447.093 351.16 327.05, 285.04, 151.00GL F3香葉木素-7-O-β-D-葡萄糖苷C22H22O1126.60[M－H]?461.108 93461.109 072.67 298.05,283.02,269.042 55.03GL F4*木犀草素C15H10O632.16[M＋H]?285.040 46285.040 473.88 267.03, 151.00, 133.03, 87.04GL F5*芹菜素C15H10O537.45[M－H]?269.045 54269.045 654.46 225.06, 151.00, 107.01GL F6香葉木素C16H12O614.49[M＋H]+301.070 66301.068 94?5.73151.00, 107.01GL A1*精氨酸C6H14N4O21.50[M＋H]+175.118 95175.118 90?0.30158.09, 130.10, 116.07, 112.09GL、XB A2*纈氨酸C5H11NO21.58[M＋H]+118.086 25118.086 18?0.6472.08, 57.06, 55.05GL、XB A3谷氨酰胺C5H9NO41.21[M＋H]+148.060 43148.060 10?2.26130.05, 120.08, 102.05, 84.04GL、XB A4蒜氨酸C6H11NO3S1.54[M＋H]+178.053 24178.053 22?0.12160.04, 91.02, 88.04XB A5L-亮氨酰-L-脯氨酸C11H20N2O31.65[M＋H]+229.154 66229.154 60?0.30116.07, 86.10, 70.07GL A6脯氨酸C5H9NO21.53[M＋H]+116.070 60116.070 48?1.0898.06, 74.02, 70.07GL A7焦谷氨酸C5H7NO31.66[M＋H]+130.049 86130.049 930.46 112.05, 102.05, 84.04GL A8亮氨酸C6H13NO21.78[M＋H]+132.101 90132.101 85?0.4286.10, 69.07GL

續表1

編號成分名稱分子式tR/min離子模式理論值實測值誤差(×10?6)二級離子碎片來源 A9苯丙氨酸C9H11NO22.37[M＋H]+166.086 25166.086 320.39149.06, 131.05, 120.08, 79.05GL A10*色氨酸C11H12N2O24.48[M＋H]+205.097 15205.097 03?0.61188.07, 170.06, 118.06XB O1煙酸C6H5NO21.63[M＋H]+124.039 30124.039 310.0480.05GL O24-羥基-煙酸C6H5NO31.67[M＋H]+140.034 21140.034 18?0.28121.03, 94.03GL O3肉桂酸C9H8O22.36[M＋H]+149.059 70149.059 750.30131.05, 103.05, 79.05GL O4原兒茶酸C7H6O423.62[M＋H]+155.033 88155.033 80?0.06135.01, 109.03, 91.09GL O5香草酸C8H8O48.47[M＋H]+169.049 53169.049 791.51152.01, 123.04, 108.02GL O69-氧代壬酸C9H16O342.94[M＋H]+173.117 22173.116 87?2.21153.09, 125.10GL O8水楊酸C7H6O319.90[M－H]?137.024 41137.024 297.08 109.03, 93.03GL O99S,13R-12-oxophytodienoic acidC18H28O340.92[M＋H]+293.211 12293.210 69?1.47275.20, 219.17, 205.16, 149.10GL O10天師酸C18H34O542.71[M－H]?329.233 34329.233 373.40 311.22, 293.21, 229.14, 171.10GL O112-羥基-6-(4-羥基苯乙基)苯甲酸C15H14O441.50[M－H]?257.081 93257.081 944.30 213.09, 107.05, 93.03XB O12十八碳三烯酸C18H30O347.35[M＋H]+295.226 77295.226 26?1.73277.22, 259.20, 99.08GL O133-甲酰基-2-甲基苯甲酸C9H8O31.69[M＋H]+165.054 62165.054 60?0.13150.03, 122.04, 79.05XB O14亞油酸C18H32O29.62[M－H]?279.232 95279.232 572.55279.23GL、XB O15瓜蔞酸C18H30O250.06[M＋H]+279.231 85279.231 35?1.82261.22, 137.13, 123.12, 109.10GL N1腺苷C10H13N5O41.63[M＋H]+268.104 03268.103 91?0.45136.06, 119.03GL、XB N3腺嘌呤C5H5N51.56[M＋H]+136.061 77136.061 72?0.38119.03, 94.04, 67.03GL、XB N4鳥嘌呤核苷C10H13N5O51.70[M＋H]+284.098 94284.098 72?0.79152.06, 135.03, 110.03GL、XB N5胸腺嘧啶核苷C10H14N2O52.31[M－H]?241.082 99241.082 412.12151.05, 125.04GL AN2葫蘆巴堿C7H7NO26.34[M＋H]+138.054 95138.054 980.18120.04, 110.06, 94.06GL AN31-羥甲基-2-吡咯醛C6H7NO23.74[M＋H]+126.054 95126.054 67?2.26108.04, 98.06, 80.05XB AN42,3,4,9-四氫-1H-β-咔啉-3-甲酸C12H12N2O28.40[M＋H]+217.097 15217.097 431.27171.09, 144.08, 130.07, 86.02XB AN59H-吡啶并[2,3-B]吲哚C11H8N212.23[M＋H]+169.076 02169.075 96?0.38169.07, 93.03XB AN64-[2-甲酰基-5-(羥甲基)-1H-吡咯-1-基]丁酸C10H13NO410.54[M－H]?210.077 18210.077 014.41124.04, 94.03, 66.03GL AN71-甲基-2,3,4,9-四氫-1H-β-咔啉-羧酸C13H14N2O29.52[M＋H]+231.112 80231.112 69?0.49214.09, 144.08, 130.06, 102.06XB AN9正香豆酰酪胺C17H17NO328.24[M＋H]+284.128 11284.127 90?0.77164.07, 147.04, 121.06, 103.05XB AN10順式-N-阿魏酰酪胺C18H19NO430.03[M＋H]+314.138 68314.138 61?0.24177.05, 149.06, 121.06, 93.07GL AN111-羧丙基-5-乙氧甲基-1H-吡咯-2-醛-吡咯C12H17NO41.89[M＋H]+240.123 03240.122 96?0.31124.04, 94.03, 66.03GL AN124-氨基苯甲酸丁酯C11H15NO230.07[M＋H]+194.117 55194.117 740.95138.05, 110.06, 94.07GL AN13酒渣堿C17H12N2O431.59[M＋H]+309.086 98309.086 70?0.92281.09, 263.08, 235.09, 206.08GL S1知母皂苷CC45H74O1835.61[M＋H]+903.494 79903.494 20?0.66741.44, 579.39, 435.28, 417.34XB S2知母皂苷A-IIIC39H64O1336.61[M＋H]+741.441 96741.440 43?2.08579.39, 435.27, 417.34, 273.22XB S3薯蕷皂苷元-3-O-β-D-吡喃-葡萄糖苷C33H52O841.72[M＋H]+577.373 49577.373 05?0.77415.32, 273.22, 255.21XB S47-羥基色原酮C9H6O314.76[M－H]?161.024 41161.024 326.21161.02 S5gitogeninC27H44O445.50[M＋H]+433.331 23433.330 57?1.54415.32, 397.31, 289.22, 271.20XB

續表1

*由對照品比對確定 F-黃酮類 A-氨基酸類 O-有機酸類 N-核苷類 AN-生物堿及含氮類 S-皂苷類 V-揮發油類 C-糖類 Other-其他類 GL-瓜蔞藥材 XB-薤白藥材 GXD-瓜蔞薤白湯

*determined by reference substance F-flavonoids A-amino acids O-organic acids N-nucleoside AN-alkaloids and nitrogens S-saponins V-volatile oils C-carbohydrate Other-other classes GL-XB-GXD-Gualouxiebai Decoction

3.1.2 體內入血成分鑒定 給藥組血清總離子流圖如圖2所示，共鑒定出23個入血成分，詳見表2。

3.1.3 體內外成分鑒定 瓜蔞薤白湯中共鑒定出68個成分，入血成分中鑒定出23個，以黃酮類F4為例，該化合物在正離子模式下分子離子峰為287.05，經Xcalibur軟件擬合得到其對應分子式C15H10O6，通過分析其二級并通過對照品比對，鑒定F4為木犀草素，裂解規律見圖3-A。以有機酸類O5在負離子模式下分子離子峰為152.01，經Xcalibur軟件擬合得到其對應分子式為C8H8O4，根據該化合物的精確相對分子質量、斷裂方式，分析其二級碎片離子信息，最終確定O5為香草酸，裂解規律見圖3-B。

3.2 生物信息學研究

3.2.1 瓜蔞薤白湯活性成分的篩選與靶點的預測 瓜蔞薤白湯入血成分均通過SwissADME篩選，利用SwissTargetPrediction數據庫，下載活性成分的靶點表格，規定probability≥1倍中位數為篩選條件，合并去重后得到396個瓜蔞薤白湯潛在作用靶點。

3.2.2 冠心病靶點的篩選 在GenenCards數據庫中，以“coronary heart disease”為關鍵詞，設置relevance score≥30為篩選條件，得到靶點379個。同樣將以上關鍵詞輸入到OMIM和DrugBank數據庫，分別得到553、35靶點。在DisGeNET數據庫中，篩選出score值大于等于2倍中位數的靶點415個。最后將4個數據庫得到的靶點求并集，刪去重復項后共得到1185個冠心病候選靶點。

3.2.3 核心靶點的篩選及PPI網絡圖的構建 將瓜蔞薤白湯活性成分對應的396個靶點與冠心病相關的1185個疾病靶點取交集，得到70個瓜蔞薤白湯防治冠心病的潛在靶點（圖4）。將獲得的70個核心靶點上傳至STRING數據庫，蛋白種屬為“homo sapiens”，置信度為0.4，刪除游離靶點，得到PPI網絡的TSV文件，將其導入Cytoscape 3.7.2構建PPI網絡（圖5）。該網絡共有67個節點，492條邊。

A-空白血清正離子模式 B-含藥血清正離子模式 C-空白血清負離子模式 D-含藥血清負離子模式

表2 瓜蔞薤白湯23個入血成分質譜信息

Table 2 Mass spectrum information of 23 absorbed components of Gualouxiebai Decoction in plasma

編號鑒定成分分子式tR/min離子模式理論值實測值誤差(×10?6)碎片離子 F4木犀草素C15H10O66.91[M＋H]+287.055 01287.054 32?2.40287.05, 269.04, 153.02, 135.04, 89.04 F5芹菜素C15H10O531.44[M＋H]+271.060 09271.058 41?6.24271.06, 153.02, 91.05 A2纈氨酸C5H11NO21.24[M＋H]+118.086 25118.086 15?0.11118.09, 57.06 A4蒜氨酸C6H11NO3S1.32[M＋H]+178.053 24178.053 421.01132.04, 91.02, 88.04 A7焦谷氨酸C5H7NO31.17[M＋H]+130.049 86130.049 930.46130.05, 84.04 A9苯丙氨酸C9H11NO21.37[M＋H]+166.086 25166.086 14?0.69149.06, 131.05, 120.08, 79.05 A10色氨酸C11H12N2O21.37[M＋H]+205.097 15205.096 97?0.90205.10, 188.07, 170.06, 118.06 O3肉桂酸C9H8O236.16[M＋H]+149.059 70148.051 88?0.98149.06, 103.05, 79.05 O5香草酸C8H8O41.35[M－H]?167.03498167.034 745.12152.01, 123.04, 108.02 O8水楊酸C7H6O314.89[M＋H]+139.038 97139.038 970.86109.03, 93.03 O10天師酸C18H34O521.70[M－H]?329.233 34329.233 281.03229.14, 211.13, 171.10 O12十八碳三烯酸C18H30O337.82[M＋H]+295.226 77295.227 170.40259.20, 99.08, 81.07 O14亞油酸C18H32O243.92[M－H]?279.232 95279.231 841.05279.23, 261.22 O15瓜蔞酸C18H30O228.88[M＋H]+279.231 85279.231 41?1.60279.23, 149.02, 121.03 AN2葫蘆巴堿C7H7NO21.21[M＋H]+138.054 95138.054 95?0.04110.06, 94.07 AN124-氨基苯甲酸丁酯C11H15NO28.41[M－H]?192.103 00192.102 392.52138.05, 110.06, 94.07 AN13酒渣堿C17H12N2O418.61[M＋H]+309.086 98309.086 00?3.18281.09, 263.08, 235.09, 206.08 S47-羥基色原酮C9H6O316.82[M－H]?161.024 41161.024 406.70161.02 S5gitogeninC27H44O433.74[M－H]?431.316 68431.317 384.16431.32 V2鄰苯二甲酸二丁酯C16H22O437.66[M＋H]+279.159 08279.159 00?0.31167.03, 149.02, 121.03, 93.03 C3半乳糖酸-γ-內酯C6H10O61.16[M－H]?177.040 46177.040 456.13177.04 Other6黑麥草內酯C11H16O38.98[M＋H]+197.117 22197.117 11?0.56197.12, 151.11 Other8前列腺素E1C20H35O424.47[M＋H]+355.247 90355.245 18?2.72355.24

A-木犀草素裂解途徑 B-香草酸裂解途徑

3.2.4 生物過程和通路富集分析 通過Metascape數據庫對70個核心靶點進行KEGG富集分析，共獲得158條結果（＜0.01），根據值排序結果，篩選出10條排名最高的富集通路（表3），包括脂質與動脈粥樣硬化（lipid and atherosclerosis）、癌癥的途徑（pathways in cancer）、腫瘤壞死因子信號通路（TNF signaling pathway）、IL-17信號通路（IL-17 signaling pathway）、核因子κB信號通路（NF?κB signaling pathway）、絲裂原激活蛋白激酶信號通路（MAPK signaling pathway）、PPAR信號通路（PPAR signaling pathway）等，見圖6。GO功能富集分析，主要包括生物過程（biological process，BP）、細胞組成（cellular component，CC）與分子功能（molecular function，MF）。共獲得640個GO富集分析結果（＜0.01），根據值簡單排序后，選取前15個生物過程、前10個細胞組成和前10個分子功能組成GO富集分析柱形圖，見圖7。GO-BP分析可得到447個條目，發現瓜蔞薤白湯防治冠心病富集在循環系統進程、蛋白質磷酸化的正調控、激素水平調節、激素應答等BP；GO-CC分析得到90個條目，發現其富集在脂筏、膜側、受體復合物、細胞質核周區等CC；GO-MF分析得到103個條目，發現其富集在脂質結合、內太酶活力以及蛋白域特異結合等MF。

圖4 瓜蔞薤白湯活性成分靶點與冠心病靶點韋恩圖

圖5 瓜蔞薤白湯治療冠心病的PPI網絡

表3 瓜蔞薤白湯治療冠心病的核心靶點拓撲參數

Table 3 Topological parameters of core target points of GXD in the treatment of CHD

靶點名稱節點連接度中介中心度接近中心度 TNF480.154 478 820.295 212 77 EGFR380.076 417 900.371 266 00 PTGS2370.063 171 650.411 411 41 MMP9330.023 187 930.492 424 24 ACE320.064 436 540.425 403 23 CASP3320.045 133 930.453 629 03 ICAM1300.022 580 280.487 356 32 TLR4290.026 208 550.482 758 62 ESR1280.041 416 950.410 052 91 PPARG270.041 175 000.424 501 42

3.2.5 “活性成分-核心靶點-通路”網絡圖的構建 將瓜蔞薤白湯活性成分、信號通路、核心靶點導入Cytoscape 3.7.2軟件，得“活性成分-核心靶點-通路”網絡圖，見圖8。網絡圖中包括99個節點（包括65個核心靶點，23個活性成分，10個通路節點）和193條邊。成分-靶點-通路網絡圖靶點最大degree值為25，最小為1。平均度值4，平均介數為0.037，平均接近值為0.31，其中有5個成分、10個靶基因，5條通路在平均值以上。推測前列腺素E1（Other8）、芹菜素（F5）、木犀草素（F4）、亞油酸（O14）、酒渣堿（AN13）為瓜蔞薤白湯治療冠心病的關鍵成分。PTGS2、TNF、MMP9、EGFR、CASP3、AR、ACE、ESR2、MMP2、F2為瓜蔞薤白湯治療冠心病的主要靶點。通路方面則集中在脂質與動脈粥樣硬化（lipid and atherosclerosis）、癌癥的途徑（pathways in cancer）、腫瘤壞死因子信號通路（TNF signalingpathway）、核因子κB信號通路（NF?κB signaling pathway）、絲裂原激活蛋白激酶信號通路（MAPK signaling pathway）。

圖6 瓜蔞薤白湯防治冠心病核心靶點KEGG富集分析

3.3 分子對接驗證

以前列腺素E1、芹菜素、木犀草素、酒渣堿為配體，PTGS2、TNF、MMP9、EGFR為受體進行結合能力預測，見圖9。對接結果只保留每對分子對接的predicted binding affinity絕對值最高的。一般認為結合能小于?4.25 kJ/mol提示配體與受體有一定的結合活性，小于?5.0 kJ/mol有較好的結合活性，小于?7.0 kJ/mol有強烈的結合活性[10]。本實驗對接得分均≤?4.25 kJ/mol，其中對接得分≤?9.0 kJ/mol的成分占37.5%，對接得分在?9.0～?7.0 kJ/mol的成分也占37.5%。木犀草素和PTGS2、EGFR對接得分最高，可視化結果見圖10。

圖7 瓜蔞薤白湯防治冠心病核心靶點的GO富集分析

圓形節點為活性成分 矩形為靶點 菱形為通路

4 討論

瓜蔞薤白湯具有振奮胸陽，行氣散結的功效，是治療冠心病的經典方劑，臨床應用廣泛且療效顯著。本研究采用液質聯用技術對瓜蔞薤白湯體內外成分進行全面鑒定，并基于多成分、多靶點的研究思路，應用網絡藥理學技術，分析瓜蔞薤白湯治療冠心病的關鍵靶點，闡述其作用機制，為瓜蔞薤白湯的臨床應用提供科學依據。

圖9 靶蛋白-活性成分分子對接得分熱圖

本實驗體外共識別出包括黃酮類、氨基酸類、有機酸類等68個化學成分，隨后在大鼠給藥血清樣本中捕捉到了23個入血成分。網絡藥理學研究結果表明瓜蔞薤白湯可以通過多通路多靶點發揮療效，“活性成分-核心靶點-通路”網絡圖提示，前列腺素E1（Other8）、芹菜素（F5）、木犀草素（F4）、酒渣堿（AN13）、亞油酸（O14）可能是瓜蔞薤白湯治療冠心病的關鍵成分。前列腺素E1（Other8）屬于血管活性藥物，可以抑制血小板活化，改善紅細胞變形能力[11]；同時可以抑制血管平滑肌細胞內鈣離子內流，使血管平滑肌舒張[12]；此外臨床研究表明前列腺素E1能抑制動脈粥樣硬化斑塊的形成[13]。黃酮類成分在瓜蔞薤白半夏湯治療冠心病中起到了較為重要的作用，芹菜素、木犀草素是2種天然的類黃酮化合物。有研究發現[14]，芹菜素通過抑制NF-κB信號通路，顯著降低NF-κB、COX-2、TNF-α的水平，提高IL-10的水平，發揮抗動脈粥樣硬化的效果。木犀草素具有抗動脈粥樣硬化[15]、維持Ca2+的平衡[16]、心肌細胞保護[17]等作用。由此可知PTGS2、TNF、MMP9、EGFR、CASP3、AR、ACE、ESR2、MMP2、F2可能為瓜蔞薤白湯治療冠心病的主要靶點。PTGS2也被稱為環氧化酶2（cyclooxygenase-2，COX-2），可以引起前列腺素（prostaglandin E1，PGE1）、PEG2和PGI2等含量升高，導致炎癥反應，研究發現COX-2抑制藥可減輕炎癥，舒張血管平滑肌[18]。TNF能誘導白細胞介素- 6（interleukin 6，IL-6）的產生，導致血管內粥樣硬化斑塊的形成[19]。有研究發現[20-21]，冠心病患者的平滑肌細胞中MMP2和MMP9的表達顯著增加，提示MMP2/MMP9在冠心病的發病過程中起著重要的作用。

圖10 靶蛋白-活性成分分子對模式圖

綜上所述，瓜蔞薤白湯中芹菜素、木樨草素、酒渣堿、亞油酸等核心功效成分作用于PTGS2、TNF、MMP9等靶點，通過脂質與動脈粥樣硬化、癌癥的途徑、腫瘤壞死因子信號通路、NF?κB信號通路、MAPK等信號通路發揮治療冠心病的功效。該研究體現了中藥復方多成分、多靶點、多途徑的特點，可為臨床上的合理應用提供科學依據。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Explore potential pharmacodynamic substances basis and mechanism of Gualouxiebai Decoction in treatment of coronary heart disease based on UHPLC-Q-Orbitrap HRMS and bioinformatics

SUN Zhi1, 2, ZHANG Yuan-yuan1, 2, ZHOU Sheng-nan1, 2, LIU Li-wei1, 2, BAO Xiao-yue1, 2, CHENG Wen-bo3, LI Xiao-qiang3, WANG Jing1, 2, ZUO Li-hua1, 2

1. Department of Pharmacy, The First Affiliated Hospital of Zhengzhou University, Zhengzhou 450052, China 2. Henan Engineering Research Center of Clinical Mass Spectrometry for Precision Medicine, Zhengzhou 450052, China 3. Suzhou Institute of Biomedical Engineering Technology, Chinese Academy of Sciences, Suzhou 215163, China

To systematically analyze and identify chemical constituents of Gualouxiebai Decoction, and predict the pharmacological basis and mechanism of its prevention and treatment of coronary heart disease.Gualouxiebai Decoction and drug-containing serum were analyzed by UHPLC-Q-Orbitrap HRMS, and the identification ofandcomponents were carried out with retention time, precise molecular weight, fragment ions and neutral loss. Bioinformatics methods were used to enrich the GO and KEGG pathways of potential targets. The network diagram of "active component-key target-pathway" of Gualouxiebai Decoction was constructed with Cytoscape 3.7.2 to predict potential active ingredients and pathways. AutoDock Tools 1.5.6 was used to verify the molecular docking between active ingredients and core targets.A total of 68 chemical components were identified, and 23 components were detected in serum samples of rats after gaved Gualouxiebai Decoction. Among them, apigin, luteolin, leae alkaloid, linoleic acid and other compounds are the key components of Gualouxiebai Decoction in the treatment of coronary heart disease, and PTGS2, TNF, MMP9, EGFR, CASP3 are the main targets. It involves the pathways of lipid and atherosclerosis, pathways in cancer, TNF signaling pathway, NF-κB signaling pathway and MAPK signaling pathway.This study preliminarily identified the potential effective components of Gualouxiebai Decoction in the prevention and treatment of coronary heart disease, and predicted the target of action, providing a reference for the further study of the pharmacodynamic substance basis and action mechanism of this prescription.

Gualouxiebai Decoction; UHPLC-Q-Orbitrap HRMS; absorbed components in the blood; bioinformatics; molecular docking;apigin; luteolin; leae alkaloid

R284.1

A

0253 - 2670(2022)18 - 5613 - 12

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.18.004

2022-05-11

河南省重點研發與推廣專項（科技攻關）（202102310187）；國家重點研發計劃資助項目（2021YFC2401105）；河南省中青年衛生健康科技創新優秀青年人才培養項目（YXKC2020058）；國家自然科學基金資助項目（82003921）

孫 志，博士，研究方向為中藥藥物代謝。Tel: (0371)66862570 E-mail: sunzhi2013@163.com

[責任編輯 王文倩]