GALNT2通過EGFR信號通路影響胰島素自身免疫綜合征的作用機制

奧日瀚，格日勒圖

（1.內蒙古自治區人民醫院內分泌科，內蒙古 呼和浩特 010017；2.內蒙古自治區人民醫院眼科）

胰島素自身免疫綜合征又稱自身免疫性低血糖，是由于血中非外源性胰島素誘導產生高濃度免疫活性胰島素和高效價胰島素自身抗體引起的，以反復發作性、嚴重自發性低血糖為特征的一種罕見病[1，2]。胰島素自身免疫綜合征在1970年由日本Hirata首次報道，故又稱Hirata病，在日本被列為自發性低血糖癥的第三大原因，需要與胰島素瘤和胰腺外腫瘤相互區分[3]。目前胰島素自身免疫綜合征的確切發病機制尚不明確，但是被廣泛認可的原因是與自身免疫缺陷和含巰基藥物的作用相關，產生胰島素自身抗體導致高胰島素血癥，引發低血糖[4，5]。

糖基化修飾是常見的蛋白質翻譯后修飾類型之一，影響著如細胞增殖、遷移、凋亡等多種細胞功能[6，7]。研究表明蛋白質主要有N型和O型兩種糖基化修飾類型，而GALNT2是調控黏蛋白O型糖基化起始步驟的重要酶[8，9]。有研究發現GALNT2的表達與酪氨酸激酶受體的活化有關，而EGFR是最早報道也是研究最多的酪氨酸激酶的受體，可以通過下游的PI3K/AKT信號通路參與細胞信號轉導和多種細胞功能調節[10，11]。在肝癌細胞等腫瘤細胞中，GALNT2可以通過糖基化修飾EGFR，進而促進EGFR的磷酸化，激活其下游信號通路，影響腫瘤細胞的惡性程度[12]。

GALNT2和EGFR在多種腫瘤的惡性進展中發揮的功能已經被多次報道，然而在代謝疾病發生發展中所起的作用，以及對該作用的分子機制卻仍需要探索。本研究表明GALNT2通過影響EGFR的翻譯后修飾，激活PI3K/AKT信號通路，從而促進PPAR-γ和PEPCK的表達，提高了細胞對葡萄糖的攝取和代謝。胰島素自身免疫綜合征患者在發病時會呈現血糖高低交替現象，并且出現嚴重的糖尿病酮癥酸中毒和低血糖[13]。我們的結果證實GALNT2通過EGFR及其下游信號通路，參與了細胞內的葡萄糖代謝過程，引起體內血糖和胰島素水平的變化，GALNT2的異常表達可能是胰島素自身免疫綜合征發病的原因之一。

1 材料與方法

1.1 細胞培養與細胞轉染

使用含有10%胎牛血清的DMEM培養基，在37℃恒溫、CO2濃度為5%及飽和濕度的細胞培養箱中進行培養。為了防止細菌污染，培養基可添加青/鏈霉素抗生素，其中青霉素的終濃度為100 U/mL，鏈霉素的終濃度為100μg/mL。使用陽離子脂質體轉染試劑轉染細胞。提前24 h接種待轉染的細胞，細胞密度以第二天轉染時匯合度達到50%~70%為宜。將過表達質?；蛘遱iRNA與轉染試劑加入到不含血清的DMEM培養基中吹打混勻，室溫孵育20 min，逐滴加入上述轉染混合液，輕輕混勻后放于培養箱中培養。轉染后6~8 h更換新鮮培養基，并繼續培養24~48 h后進行后續實驗。

1.2 蛋白免疫印跡（Western blot）

收集處理后的各組細胞，用RIPA裂解液置于冰上裂解30 min，然后用BCA蛋白定量試劑盒進行蛋白濃度的測定。取20~60μg蛋白樣品，用SDSPAGE進行分離，將分離后的蛋白質轉移到NC膜上，5%BSA室溫封閉1~2 h，分別加入稀釋的一抗4℃孵育過夜，洗膜后加入對應種屬的HRP標記的二抗，室溫孵育1 h，使用化學發光法進行曝光顯影，以β-actin作為內參。

1.3 凝集素下拉試驗

將細胞裂解液與長柔毛野豌豆外源凝集素瓊脂糖珠在4℃共同孵育12 h，通過離心收集凝集素/糖蛋白復合物。將凝集素/糖蛋白煮沸變性分離，用Western blot檢測發生O型糖基化的EGFR蛋白含量，以細胞內總EGFR蛋白含量作為對照。

1.4 葡萄糖、乳酸和NADP+/NADPH含量檢測

將待檢測細胞接種至6孔板中，待細胞生長至90%匯合度時，更換新鮮培養基繼續培養6 h，收集上清液用葡萄糖分析試劑盒和乳酸分析試劑盒測定葡萄糖和乳酸的含量，通過從培養基初始濃度中減去最終濃度來計算葡萄糖消耗量。使用NADP+/NADPH分析試劑盒在450 nm的光密度下測定細胞裂解物中的NADP+/NADPH比率。

1.5 RNA提取和RT-qPCR實驗

使用Trizol試劑提取總RNA，取1μg總RNA按照試劑盒說明書反轉錄成cDNA。對合成的熒光定量PCR試劑盒進行RT-qPCR檢測，取2μL cDNA作為模板，加入特異基因引物，50μL體系進行擴增，每個孔均設置3個重復，以β-actin作為內參。

1.6 細胞葡萄糖攝取能力檢測

將待檢測細胞接種至96孔板中，待細胞生長至90%匯合度時，用不含葡萄糖的DMEM培養基清洗細胞2次后，加入不含葡萄糖的培養基培養15 min。加入用不含葡萄糖的培養基稀釋的探針，37℃下培養15 min，洗去多余的探針后在熒光顯微鏡下觀察葡萄糖攝取情況。

1.7 統計學方法

所有數據均采用SPSS 21.0統計學軟件進行處理，計量資料采用均值±標準差的形式表示，兩組間比較采用t檢驗。檢驗水準為α＝0.05，當P＜0.05時，認為兩組樣本均值之間差異有統計學意義。

2 結果

2.1 GALNT2對EGF刺激下EGFR磷酸化的影響

將轉染GALNT2過表達質粒和轉染siRNA的L-02細胞無血清處理6 h，隨后加入100 ng/mL的EGF刺激10 min，隨后收集細胞進行Western blot試驗。結果表明過表達GALNT2增強了EGF誘導的EGFR磷酸化水平，而敲低GALNT2的細胞EGFR磷酸化水平明顯降低（見圖1）。

圖1 GALNT2對EGF刺激下EGFR磷酸化的影響

2.2 GALNT2對EGFR的O型糖基化水平的影響

為了探究GALNT2是否影響EGFR在L-02細胞中的O型糖基化水平，我們進行了凝集素下拉試驗。如圖2所示，過表達GALNT2增加了EGFR的O型糖基化，而敲低GALNT2的細胞EGFR的O型糖基化水平降低。

圖2 GALNT2對EGFR的O型糖基化水平的影響

2.3 GALNT2對EGFR下游PI3K/AKT通路活性的影響

前面的實驗結果證實了在L-02細胞中GALNT2能夠促進EGFR的磷酸化，隨后我們檢測了EGFR的下游信號通路。結果表明，過表達GALNT2能夠促進AKT和mTOR的磷酸化，激活PI3K/AKT通路。而同時加入PI3K抑制劑LY294002則逆轉了GALNT2的作用，表明GALNT2確實是通過PI3K/AKT信號通路發揮功能（見圖3）。

圖3 GALNT2對EGFR下游PI3K/AKT通路活性的影響

2.4 GALNT2對細胞代謝能力的影響

過表達GALNT2的細胞培養基中的葡萄糖消耗增加（t=5.856，P＜0.05），乳酸生成增加（t=5.543，P＜0.05），并且細胞內的NADPH/NADP+比例升高（t=4.364，P＜0.05），而同時加入PI3K抑制劑LY294002則逆轉了GALNT2的作用，表明GALNT2能夠通過PI3K/AKT信號通路促進細胞代謝（見表1）。

表1 GALNT2對細胞代謝能力的影響

2.5 GALNT2對PPAR-γ和PEPCK表達的影響

隨后我們檢測了糖代謝通路下游基因PPAR-γ和PEPCK的mRNA水平，結果表明過表達GALNT2的細胞中PPAR-γ和PEPCK的mRNA含量升高（**P＜0.05）（見圖4）。

圖4 GALNT2對PPAR-γ和PEPCK表達的影響

2.6 GALNT2對胰島素抵抗模型的細胞葡萄糖攝取能力的影響

最后我們用含有1μmol/L胰島素的DMEM培養基處理細胞16 h，構建胰島素抵抗模型，通過葡萄糖攝取實驗表明GALNT2增強了胰島素抵抗模型的細胞對葡萄糖攝取能力（見圖5）。

圖5 GALNT2對胰島素抵抗模型的細胞葡萄糖攝取能力的影響

3 討論

胰島素自身免疫綜合征是一種比較罕見的疾病，可以引發低血糖甚至死亡，在國內外也都有誤診為胰島細胞瘤而進行手術的病例報告[14]。這提醒我們正確全面地認識這一疾病，探究其發病因素顯得尤為重要。我們的研究結果表明，GALNT2通過影響EGFR及其下游信號通路，促進了細胞內的葡萄糖代謝過程，是導致機體血糖降低的原因之一，也初步揭示了胰島素自身免疫綜合征的發病的可能機制。

胰島素自身免疫綜合征的治療主要以清除胰島素自身抗體、及時糾正并預防低血糖的發生為主。治療措施包括停用可能誘發自身免疫的藥物、調整飲食結構、選用阿卡波糖，通過延緩葡萄糖的吸收和降低胰島素的分泌而發揮作用。對于低血糖反復發作且難以控制的患者，可以口服糖皮質激素或進一步使用免疫抑制劑，病情嚴重的患者甚至需要血漿置換。我們的研究表明，PI3K的抑制劑LY294002能夠逆轉GALNT2對葡萄糖代謝的影響，延緩細胞代謝速率，對于胰島素自身免疫綜合征患者可能會有積極的作用，在將來的研究中我們可以嘗試使用EGFR信號通路的抑制劑來治療胰島素自身免疫綜合征等細胞代謝疾病。

有研究報道，GALNT2基因多態性與血脂HDLC和TG水平密切相關[15，16]。在GALNT2基因的第一個內含子中存在6個研究較多的突變位點，不同的突變位點具有不同的生物學特性，在未來的研究中會不斷發掘GALNT2基因多態性與包括胰島素自身免疫綜合征在內的多種疾病發生的關系。對GALNT2的生理功能進一步探索，將有助于設計針對GALNT2功能的藥物，從平衡細胞內的O型糖基化水平的角度來治療各類疾病，拓寬包括抗惡性腫瘤與調節代謝疾病等方面藥物的開發視野，為全人類的健康事業作出更多的貢獻。