Toll樣受體2在泛癌中的表達、對預后的影響及其作用機制

陳勝武，趙恒伍，高軼軒

（錦州醫科大學附屬第三醫院骨科，遼寧 錦州 121001）

隨著細胞生物學和分子生物學研究的不斷深入，腫瘤免疫治療蓬勃發展，已經成為多種惡性腫瘤的重要治療手段。腫瘤免疫治療主要是通過免疫誘導劑使機體產生腫瘤特異性免疫應答來抑制和殺傷腫瘤細胞，相較于傳統的放化療，其優勢在于廣譜和持久。Toll樣受體（Toll-like receptor，TLR）在免疫細胞中幾乎無處不在，它們通過識別病原體、介導內源性損傷等方式發揮作用［1］。迄今為止，已在人類中鑒定出11種功能不同的TLR，并將其分為跨膜TLR（TLR1、TLR2、TLR4、TLR5、TLR6和TLR11）和細胞內TLR（TLR3、TLR7、TLR8和TLR9）。已有研究［2］表明，TLR在正常細胞和腫瘤細胞的增殖和凋亡中發揮調節作用，TLR信號傳導失調會導致促進腫瘤生長的微環境。前期研究［3］表明，TLR2在骨關節炎和腰椎間盤退變中發揮重要作用。TLR2可以刺激細胞中趨化因子和危險相關分子的釋放，在腫瘤細胞中表現為促進腫瘤存活和進展。但在肺癌中，TLR2高表達患者預后更好［4］。研究［5］發現，TLR2參與乳腺癌的免疫調節。還有研究［6］證明，TLR2在肝細胞癌中介導更強的細胞毒性和增殖能力。這些研究結果表明TLR2在某些腫瘤的免疫調節中具有重要作用，但目前尚無研究對泛癌中TLR2的作用機制進行全面研究。

因此，本研究應用UCSC Xena數據庫分析TLR2在腫瘤和正常組織中的差異表達，明確TLR2是否為泛癌中的重要基因，應用R語言survival包和survminer包分析TLR2高表達對患者預后的影響，應用cBio-Portal數據庫分析TLR2基因變異情況，應用TIMER數據庫分析TLR2在免疫細胞浸潤中的作用，應用基因集富集分析（gene set enrichment analysis，GSEA）數據庫分析TLR2的生物學功能。

1 材料與方法

1.1 TLR2在腫瘤中的表達

從UCSC Xena數據庫（https：//xenabrowser.net/datapages）下載癌癥基因組圖譜（The Cancer Genome Atlas，TCGA）和基因型組織表達（Genotype-Tissue Expression，GTEx）數據庫中的RNA和臨床數據。剔除單個癌種中樣本數量＜3的癌種，應用R語言（v4.0.3）對TLR2的每個表達值進行log2（x+0.001）變換，存在多轉錄本時，結果取均值，計算每種腫瘤中TLR2在腫瘤組織和正常組織的表達情況。

1.2 預后分析

分析TCGA數據庫中TLR2表達與腫瘤預后的關系。根據每種腫瘤中TLR2表達的中位數，將樣本分為TLR2高表達組和TLR2低表達組。采用R語言survival包和survminer包，分析TLR2表達水平對不同腫瘤預后的影響。風險比（hazard ratio，HR）＞1，表明TLR2高表達是泛癌的危險因素；HR＜1，表明TLR2高表達是泛癌的保護因素。

1.3 遺傳和表觀遺傳改變的分析

在cBioPortal網站（https：//www.cbioportal.org/）選擇“快速選擇”部分的“TCGA泛癌圖譜研究”，輸入“TLR2”，查詢TLR2基因變異情況。在“癌癥類型小結”模塊中可以觀察到所有TCGA數據庫腫瘤中TLR2的突變頻率、突變類型和拷貝數的改變。

1.4 TLR2與免疫學特征的相關性

通過TIMER數據庫（http：//timer.cistrome.org/）的“免疫基因”模塊，研究所有 TCGA腫瘤中TLR2表達與免疫細胞浸潤的關系。該數據庫利用R語言estimate包，根據基因表達量計算每種腫瘤中TLR2表達與各免疫調節劑的相關性。

1.5 GSEA

使用GSEA軟件Java 4.0版對TLR2進行功能富集分析。從TCGA數據庫中下載各種腫瘤的表達譜文件，每組數據根據TLR2表達量由高到低進行排序，以中位數為界將其分為TLR2高表達組和TLR2低表達組，選擇預后與TLR2表達相關的腫瘤類型，GSEA基于整體基因集進行分析，不排除差異倍數較小的基因集，使結果更為全面。基于京都基因和基因組數據庫（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）進行富集分析，以研究TLR2高表達組和低表達組間的差異途徑。顯著性設置為錯誤發現率（false discovery rate，FDR）＜0.25和P＜0.05。

1.6 統計學分析

采用R語言（v4.0.3）和SPSS 22.0軟件進行統計學分析。計量資料的比較采獨立樣本t檢驗和單因素方差分析，采用Kaplan-Meier曲線和log-rank檢驗比較生存差異。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 泛癌中TLR2的表達譜

利用TCGA數據庫和GTEx數據庫分析腫瘤組織和正常組織中TLR2的表達水平。結果顯示，TLR2表達在16種腫瘤中顯著上調，包括多形性膠質細胞瘤（GBM）、膠質瘤（GBMLGG）、腦低級別膠質瘤（LGG）、子宮內膜癌（UCEC）、食管癌（ESCA）、胃和食管癌（STES）、腎乳頭狀細胞癌（KIRP）、混合腎癌（KIPAN）、胃癌（STAD）、頭頸鱗狀細胞癌（HNSC）、腎透明細胞癌（KIRC）、甲狀腺癌（THCA）、胰腺癌（PAAD）、睪丸癌（TGCT）、腎嫌色細胞癌（KICH）、膽管癌（CHOL），在13種腫瘤中顯著下調，包括乳腺浸潤癌（BRCA）、肺腺癌（LUAD）、結腸癌（COAD）、結直腸癌（COADREAD）、前列腺癌（PRAD）、肺鱗狀細胞癌（LUSC）、肝細胞癌（LIHC）、腎母細胞瘤（WT）、黑色素瘤（SKCM）、子宮肉瘤（UCS）、白血病（ALL）、急性髓細胞樣白血病（LAML）、腎上腺皮質癌（ACC）。其中，TLR2在LAML中的相對表達量較高，提示其在LAML中發揮重要功能。見圖1。

圖1 TCGA數據庫和GTEx數據庫腫瘤組織與正常組織中TLR2的表達Fig.1 Expression of TLR2 in tumor tissue and normal tissue in the TCGA and GTEx databases

2.2 TLR2表達與患者預后的相關性

生存分析結果顯示，TLR2在7種腫瘤中HR＞1，表明TLR2高表達是其危險因素，包括GBMLGG、LGG、LAML、KIPAN、胸腺癌（THYM）、睪丸癌（TGCT）、LIHC（圖2A～2G），在7種腫瘤中HR＜1，表明TLR2高表達是其保護因素，包括LUAD、KIRP、SKCM、轉移性黑色素瘤（SKCM-M）、間皮瘤（MESO）、ALL、肉瘤（SARC）（圖2H～2N）。

圖2 TLR2表達與泛癌患者預后的相關性Fig.2 Correlation between TLR2 expression and prognosis of patients in pan cancer

2.3 TLR2在泛癌中的基因變異情況

采用cBioPortal數據庫分析泛癌中TLR2基因變異情況。泛癌中TLR2基因變異頻率由高到低前3位的腫瘤分別是UCEC、SKCM和SARC，最常見的基因變異類型是基因突變（圖3A）。基因擴增在所有腫瘤中出現頻率最低，SARC中同時存在基因突變、基因擴增和基因缺失3種變異類型。本研究共檢測到TLR2的148個突變位點（包括129個錯義突變位點和19個截斷突變位點），位于氨基酸0～784之間。見圖3B。

圖3 TLR2在泛癌中的異常表達和突變Fig.3 Abnormal expression and mutation of TLR2 in pan cancer

2.4 TLR2表達與免疫細胞浸潤的相關性

由于TLR2表達與絕大多數腫瘤中免疫細胞浸潤呈顯著正相關，因此采用TIMER數據庫分析TLR2表達與150種免疫調節劑（包括趨化因子、受體、組織相容性復合體、免疫抑制劑和免疫激動劑）的相關性。SARC中，TLR2表達與CSF1R、HAVCR2、IL-10、PDCD1LG2等免疫刺激劑的反應呈正相關。而在THYM中，TLR2表達與免疫抑制劑CD244、CD96、PDCD1、BTLA等呈負相關，這可能與采用程序性死亡受體1治療THYM卻未取得顯著療效相關。見圖4。

圖4 泛癌中TLR2表達與免疫調節劑的相關性Fig.4 Correlation between TLR2 expression and immunomodulators in pan cancer

2.5 GSEA富集分析

為了進一步闡明TLR2的生物學功能，采用GSEA軟件Java 4.0版分析KEGG數據庫中TLR2高表達組和低表達組差異富集的信號通路。結果顯示，TLR2主要富集于各種免疫和炎癥相關通路，如白細胞跨內皮遷移通路、TLR信號通路、JAK-STAT信號通路、B細胞受體信號通路、自然殺傷細胞介導的細胞毒性等。見圖5。

圖5 KEGG數據庫的基因集富集分析結果Fig.5 Gene set enrichment analysis of KEGG database

3 討論

TLR在免疫反應的激活中起關鍵作用，是促進腫瘤細胞存活的腫瘤微環境中慢性炎癥的關鍵介質。TLR2是TLR家族中研究最廣泛的成員之一。TLR2在大多數腫瘤中上調，與腫瘤轉移密切相關，作為原癌基因發揮重要作用。研究［7］報道，TLR2誘導劑FSL-1可以影響纖維肉瘤小鼠體內腫瘤細胞的生長。膠質瘤中，TLR2促進腫瘤細胞免疫逃避。TLR2多態性與乳腺癌風險相關，并有助于癌細胞侵襲［8］。

本研究采用TCGA數據庫分析34種腫瘤中TLR2的表達水平，結果顯示，腫瘤組織和正常組織間TLR2表達存在顯著差異。與正常組織相比，GBM、GBMLGG、LGG、UCEC、ESCA、STES、KIRP、KIPAN、STAD、HNSC、KIRC、THCA、PAAD、TGCT、KICH、CHOL中TLR2表達水平顯著上調，BRCA、LUAD、COAD、COADREAD、PRAD、LUSC、LIHC、WT、SKCM、UCS、ALL、LAML、ACC中TLR2表達水平顯著下調。TLR2在不同類型腫瘤組織中的表達水平存在差異，可能反映其不同的基本功能，進而影響腫瘤患者的預后。

本研究采用R語言進行生存分析，結果表明，TLR2高表達在GBMLGG、LGG、LAML、KIPAN、THYM、TGCT、LIHC中是危險因素，在LUAD、KIRP、SKCM、SKCM-M、MESO、ALL、SARC中是保護因素，其具體機制值得進一步研究。

越來越多的研究［9］表明，基因突變參與腫瘤的發生、進展和化療耐藥。最近的一項研究［10］表明，基因突變引起的Rac1活性升高或表達增加，可促進腫瘤的發生、發展、轉移和侵襲，導致患者預后不良。還有研究［11］發現，多種基因的編碼和非編碼突變以及表觀突變都對前列腺癌的預后影響巨大。本研究發現，TLR2突變在SARC、SKCM和UCEC中較為常見，這可能與其作為腫瘤保護因素的缺失相關。

本研究進一步探索TLR2在泛癌中的作用機制，結果發現，TLR2表達與腫瘤組織的免疫浸潤水平顯著相關。在大多數腫瘤中，TLR2的表達與B細胞、CD4+T細胞數量呈正相關，然而在GBMLGG、LGG中卻呈負相關，這是TLR2成為GBMLGG、LGG預后危險因素的原因之一。同時，TLR2高表達可以募集更多的巨噬細胞、自然殺傷細胞，并發揮抗腫瘤作用。這可能是LUAD、KIRP、SKCM、SARC等腫瘤中TLR2高表達患者預后較好的原因之一。在絕大多數腫瘤中，免疫細胞浸潤與TLR2表達呈顯著正相關，由此推測，在泛癌中TLR2參與了腫瘤的炎癥反應過程，與腫瘤免疫微環境密切相關。

基于上述結果，本研究采用R語言分析了TLR2表達與150種免疫調節劑（免疫激動劑、免疫抑制劑、趨化因子、感受器和主要組織相容性復合體分子）的關系。絕大部分腫瘤中，TLR2表達與CSF1R、HAVCR2、IL10、PDCD1LG2等免疫刺激劑反應呈正相關。研究［12］表明，在小鼠THYM模型中TLR2通過抑制主要組織相容性復合體Ⅱ類分子（CD244、CD96、BTLA、PDCD1等）在小膠質細胞中的表達，阻礙了CD4+T細胞的增殖和活化，從而促進了THYM免疫逃避。TGCT中，TLR2的表達與幼稚B細胞和濾泡輔助性T細胞呈負相關，表明TLR2的促腫瘤作用抑制了部分免疫反應。骨腫瘤的研究［13］證實，在骨肉瘤、卡西波肉瘤中，通過刺激TLR4可以激活自身免疫，有利于患者的預后，但尚不明確TLR2在骨腫瘤中的作用機制。已有基礎研究［14］表明，TLR2激動劑可能導致腫瘤細胞和腫瘤相關巨噬細胞中的TLR2活化，影響腫瘤發展。還有研究［15］表明，糞腸球菌脂磷壁酸和TLR2激動劑聯合應用可上調人成骨肉瘤細胞中核因子κB的表達水平。上述研究結果與本研究結果一致，表明TLR2可以作為泛癌中一個關鍵的免疫調節靶點，同時為接下來研究肉瘤中TLR2的表達及作用機制提供了理論依據。

本研究存在一定的局限性。首先，需進行進一步實驗確定TLR2在不同腫瘤發生中精確的分子功能，并通過 PCR、Western blotting等方法驗證TLR2在泛癌中的表達。其次，TCGA數據庫中的樣本量有限，SARC中正常樣本量過少，可能導致分析結果存在一定偏差。再有，需要更多的外部數據集驗證TLR2與腫瘤免疫微環境的關系。

綜上所述，本研究對TLR2進行的泛癌分析結果表明，TLR2可以作為一個新的免疫調節靶點，影響腫瘤的預后，從而為癌癥的臨床診療提供一定的理論支持。