大麻素受體2在膿毒癥大鼠急性肺損傷中的作用及其機制

宋倩，康惠文，蔣守芳，周秀云，王曉波，章義利

（1.華北理工大學公共衛生學院勞動衛生與環境衛生學學科，河北 唐山 063210；2.浙江大學醫學院附屬金華醫院血液凈化中心，浙江 金華 321000；3.浙江大學醫學院附屬金華醫院內科，浙江 金華 321000；4.浙江大學醫學院附屬金華醫院健康管理中心，浙江 金華 321000）

膿毒癥是宿主對感染產生的失控性反應，同時出現危及生命的器官功能障礙［1］。急性肺損傷（acute lung injury，ALI）是膿毒癥嚴重的并發癥之一［2］。ALI發生發展過程中，核因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB）及絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）信號通路被激活，可使炎癥介質大量釋放，進而加重肺損傷［3-4］。細胞外信號調節激酶1/2（extracellular signal regulated kinase1/2，ERK1/2）是最具代表性的MAPK之一，在膿毒癥ALI的發生發展中起重要作用［5］。目前，對膿毒癥所致ALI尚無特效治療方法，抗炎治療是一種重要和有效的治療手段［6］。大麻素受體2（cannabinoid receptor 2，CB2R）屬于G蛋白耦聯受體，主要在免疫細胞中表達［7］。激活的CB2R具有抗炎和免疫抑制作用［8］，可作為抗炎藥物用于類風濕性關節炎等多種疾病的治療［9］，因此推測CB2R有可能成為治療膿毒癥的一個新靶點。本研究擬通過脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）誘導建立大鼠膿毒癥ALI模型，并探討CB2R在膿毒癥ALI中的作用及其機制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器

LPS（中國Solarbio公司）；大鼠腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白細胞介素-1β（intertleukin-1β，IL-1β）試劑盒（中國欣博盛生物科技有限公司）；JHW133、AM630（美國APExBIO公司）；兔抗IL-1β（美國Bio-world公司）；兔源ERK1/2、p-ERK1/2（美 國Cell Signaling公 司）；兔 源TNF-α、NF-κB p65、p-NF-κB p65、β-actin（美國Affinity Biosciences公司）；反轉錄試劑盒、實時定量PCR擴增試劑盒（加拿大ABM公司）。Fluor Chem HD2型凝膠成像系統（美國Alpha公司）。

1.2 實驗動物分組及模型制備

健康SPF級SD大鼠48只，6～8周齡，體質量（180±20）g，購自北京華阜康生物科技股份公司［動物合格證號：華阜康SCXK（京）2019-0008］。實驗動物處理符合實驗動物福利倫理原則（批準文號：LX2019093）。適應性喂養1周后，將大鼠隨機分為對照組（C組）、模型組（LPS組）、CB2R激動劑組（JWH133組）和CB2R拮抗劑組（AM630組），每組12只。LPS組大鼠腹腔注射LPS（10 mg/kg）建立膿毒癥模型，JWH133組及AM630組在注射LPS前30 min腹腔注射JWH133（3.0 mg/kg）及AM630（3.0 mg/kg）。LPS注射后，LPS組和AM630組各有1只大鼠死亡。所有動物在給予LPS 6 h后腹腔注射5%水合氯醛麻醉，放血處死，收集支氣管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid，BALF）及肺組織標本。

1.3 檢測指標及方法

1.3.1 肺組織病理學檢測：（1）取右下肺組織，以4%多聚甲醛固定36 h后，常規修塊、脫水、透明、包埋、切片，HE染色后，在光鏡下觀察肺組織病理變化。（2）取肺組織進行固定、包埋、超薄切片，透射電鏡下觀察肺泡上皮細胞、線粒體、細胞核、板層小體等肺組織超微結構的改變。

1.3.2 肺組織含水率檢測：取右中肺，用濾紙拭去表面血漬，立即稱其濕質量（W）；置于80 ℃恒溫干燥箱，烘烤24 h后稱其干質量（D）。肺組織含水率=（W-D）/ W。

1.3.3 BALF中炎性細胞因子含量測定：放血處死大鼠后，打開胸腔，結扎右側肺部，剪開氣管，將生理鹽水從氣管緩慢注入大鼠左側肺泡內，然后緩慢抽出，重復 3 次，收集BALF。按ELISA試劑盒說明書步驟檢測BALF中TNF-α、IL-1β含量。

1.3.4 肺組織ERK1/2及NF-κB p65mRNA表達量檢測：TRIzol法提取肺組織RNA，應用逆轉錄試劑盒合成cDNA，按照實時定量PCR試劑盒說明書步驟，檢測mRNA表達水平，β-actin作內參照。通過 2-ΔΔCt法計算 mRNA 表達量。引物序列見表1。

表1 引物序列Tab.1 PCR primer sequences

1.3.5 肺組織TNF-α、IL-1β、ERK1/2、p-ERK1/2、NF-κB p65、p-NF-κB p65蛋白表達檢測：采用Western blotting法檢測。稱量適量肺組織，勻漿裂解后于4 ℃下14 000 r/min離心15 min，提取上清液，測定樣品蛋白濃度。取20 μg蛋白樣品，經10%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離后，轉至PVDF膜上，將膜置于2%BSA中37℃搖床封閉2 h。在含一抗2%BSA 的TBST溶液中孵育2 h或4 ℃過夜。加入HRP標記的山羊抗兔IgG二抗37 ℃搖床孵育1 h，顯影。采用圖像分析軟件計算蛋白相對表達量。

1.4 統計學分析

2 結果

2.1 肺組織病理學改變

光鏡下C組肺泡結構完整、清晰、肺泡壁厚度均勻，肺間質未見水腫現象；LPS組肺泡結構破壞嚴重，肺泡隔明顯增厚，肺間質及肺泡出現嚴重水腫，大量炎癥細胞浸潤；與LPS組相比，JWH133組肺泡結構較完整，肺泡中炎癥細胞浸潤和水腫不同程度減輕，AM630組肺泡結構破壞嚴重，肺泡中炎癥細胞浸潤和水腫加劇。見圖1。

圖1 大鼠肺組織病理變化 HE ×100Fig.1 Pathological changes of lung tissue in rats HE ×100

電鏡下C組可見形態正常的Ⅰ型肺泡上皮細胞，核仁清晰，胞質內可見線粒體，核糖體等細胞器，細胞器形態完整，數量正常；LPS組胞質內可見部分內質網擴張，細胞器減少；JWH133組受損程度較LPS組明顯改善，胞質內可見大量細胞器，且形態結構基本正常；AM630組受損程度較LPS組重，可見核周隙擴張，內質網擴張明顯，個別線粒體有水腫。見圖2。

圖2 大鼠肺組織超微結構變化 ×8 000Fig.2 Ultrastructural changes of lung tissue in rats ×8 000

2.2 肺組織含水率比較

與C組比較，LPS組和AM630組肺組織含水率均顯著升高（P＜0.05）。與LPS組相比，JWH133組肺組織含水率顯著下降（P＜0.05），AM630組肺組織含水率無統計學差異，但有升高的趨勢。見表2。

表2 各組大鼠肺組織含水率比較（，n=8）Tab.2 The rate of water content in lung tissue among different groups（，n=8）

表2 各組大鼠肺組織含水率比較（，n=8）Tab.2 The rate of water content in lung tissue among different groups（，n=8）

1）P＜0.05 vs control group；2）P＜0.05 vs LPS group.

2.3 BALF中炎性細胞因子TNF-α、IL-1β水平的變化

與C組相比，LPS組、JWH133組和AM630組BALF中TNF-α水平顯著升高（P＜0.05）；LPS組、AM630組BALF中IL-1β水平顯著升高（P＜0.05）。與LPS組相比，JWH133組TNF-α、IL-1β水平顯著下降（P＜0.05），AM630組IL-1β水平顯著升高（P＜0.05）。見表3。

表3 各組大鼠BALF中炎性細胞因子TNF-α、IL-1β的表達水平（，pg/mL，n=6）Tab.3 Expression of TNF-α and IL-1β in BALF of rats in each group（，pg/mL，n=6）

表3 各組大鼠BALF中炎性細胞因子TNF-α、IL-1β的表達水平（，pg/mL，n=6）Tab.3 Expression of TNF-α and IL-1β in BALF of rats in each group（，pg/mL，n=6）

1）P＜0.05 vs control group；2）P＜0.05 vs LPS group.

2.4 肺組織中ERK1/2、NF-κB p65mRNA表達水平比較

與C組比較，LPS組、JWH133組及AM630組ERK1/2、NF-κB p65mRNA表達水平顯著升高（P＜0.05）；與LPS組比較，JWH133組ERK1/2mRNA表達水平顯著降低（P＜0.05）。見圖3。

圖3 各組大鼠肺組織ERK1/2和NF-κB p65 mRNA表達水平比較Fig.3 Comparison of ERK1/2 and NF-κB p65 mRNA expression levels in rat lung tissues

2.5 肺組織中TNF-α、IL-1β、ERK1/2、p-ERK1/2、NFκB p65、p-NF-κB p65蛋白表達水平比較

與C組比較，LPS組和AM630組TNF-α、IL-1β、p-ERK1/2、p-NF-κB p65蛋白表達水平顯著升高（P＜0.05）；與LPS組比較，JWH133組TNF-α、IL-1β、p-ERK1/2、p-NF-κB p65蛋白表達水平顯著降低（P＜0.05），AM630組p-ERK1/2、p-NF-κBp65蛋白表達水平顯著升高（P＜0.05）。見圖4。

圖4 大鼠肺組織ERK/NF-κB通路相關蛋白表達Fig.4 Expression of ERK/NF-κB pathway related proteins in rat lung

3 討論

膿毒癥的最新定義為因宿主對感染的反應失調而導致的危及生命的器官功能障礙［10］。目前，雖然在控制膿毒癥感染反應方面的研究取得了一定進展，但仍無有效的治療藥物。內源性大麻素系統可以調節先天性免疫和獲得性免疫，改善炎癥反應、疼痛和氧化應激等［11-12］。CB1R主要在中樞神經系統表達，而CB2R主要在外周組織表達［13］。CB2R是體內重要的炎癥調節因子，通過抑制白細胞募集，減少趨化因子、黏附分子、活性氧和促炎細胞因子等的合成和釋放，產生抗炎作用［14-16］。在增生性玻璃體視網膜病早期，CB2R激動劑干預可減少眼部炎癥和疾病的嚴重程度［17］，用CB2R激動劑還可預防類風濕關節炎局部和全身炎癥性骨破壞［18］；在大鼠自發性高血壓模型中，JWH133通過減輕延髓頭端腹外側區炎癥降低大鼠血壓［19］；但CB2R在膿毒癥中的研究較少。

本研究選擇CB2R激動劑JWH133和CB2R拮抗劑AM630對大鼠ALI模型進行干預，結果發現，JWH133可顯著減輕LPS所致大鼠肺損傷及肺水腫程度，減少炎性細胞因子TNF-α、IL-1β的表達，而AM630則使上述反應均加重。提示CB2R參與了膿毒癥肺損傷的過程，可顯著減輕膿毒癥時肺部的炎癥反應，減輕LPS導致的肺損傷。

MAPK作為真核細胞胞質內的信號轉導終末通路，與膿毒癥ALI的發病機制密切相關［20］。ERK是最具代表性的MAPK之一。ERK是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，是傳遞有絲分裂原信號的信號轉導蛋白。ERK一般位于細胞質中，激活后，ERK通過磷酸化包括轉錄因子在內的多種底物控制下游反應［21］。NF-κB激活在炎性細胞因子基因轉錄中起關鍵作用，能觸發炎癥的級聯反應，可誘導包括TNF-α、IL-1β、IL-6等多種炎癥介質的表達［22］。

本研究通過腹腔注射LPS誘導膿毒癥肺損傷模型，發現ERK1和ERK2的2種同工型THr-Glu-Try基序雙重磷酸化，同時NF-κB p65磷酸化，mRNA表達水平也上調。重要的是，JWH133預處理可顯著抑制ERK及NF-κB p65的磷酸化及下調基因表達水平，炎性細胞因子TNF-α、IL-1β的表達也下降。抑制CB2R后，ERK及NF-κB p65的磷酸化水平升高，炎性細胞因子水平也隨之上升。

綜上所述，激活CB2R可抑制膿毒癥ALI大鼠的肺組織炎癥反應，改善肺組織損傷情況，其機制可能是通過調控ERK/NF-κB信號通路實現。本研究為臨床治療膿毒癥ALI提供了新的思路和方向，不足之處在于僅探討了ERK1/2-NF-κB信號通路在此過程中的作用，未探討CB2R是否還通過其他途徑產生作用，尚有待進一步研究探討CB2R的肺保護機制。肺泡上皮屏障和肺微血管內皮屏障的完整性破壞及通透性改變是ALI發生的根本原因。在神經系統的保護作用的研究中發現，CB2R在改善腦屏障功能、減輕腦水腫過程中發揮重要作用。因此，未來的研究將從CB2R對肺泡上皮細胞間屏障結構的作用等方面探討其肺保護機制。