煙草黑脛病菌膠體金免疫層析快速檢測技術的建立與評價

楊 洋，羊國根，楊懿德，許大鳳，崔權仁，李林秋，鄢 敏，周本國*，潘月敏

(1.四川省煙草公司宜賓市公司，四川宜賓 644600；2.安徽農業大學植物保護學院，安徽合肥 230036；3.安徽省農業科學院煙草研究所，安徽合肥 230031)

由煙草疫霉()引起的煙草黑脛病是煙草生產上最主要的病害之一，主要危害煙草的莖基部和根，嚴重時導致植株死亡。我國各煙區除黑龍江外均有發生，其中西南煙葉產區發病較重，每年因煙草黑脛病引起的經濟損失超過1.2億元。近年來，煙草黑脛病發病率有加重趨勢，煙草黑脛病的控制主要依賴于化學防治，長期過量使用化學殺菌劑，導致農藥殘留量超標和抗藥性菌株產生。因此，推廣煙草黑脛病的綠色防控技術，減少化學農藥使用量，保障煙葉綠色安全生產，煙草黑脛病的快速診斷是關鍵。

煙草黑脛病的傳統檢測依賴于病原菌的分離和田間癥狀觀察，而隨著分子生物學技術的快速發展，相繼出現了基于核酸的檢測體系，如常規PCR、多重PCR、熒光定量PCR和環介導等溫擴增技術等，提高了煙草黑脛病的診斷效率。膠體金免疫層析技術是1990年由Beggs等建立的一種用來檢測人尿和血清中HCG的技術，膠體金免疫層析技術具有操作簡單、檢測時間短、特異性強等特點，且不需要特殊儀器設備。目前，膠體金免疫層析技術被廣泛應用于食品安全、動物傳染病、人畜共患病、植物病害、農藥殘留和重金屬離子等方面的快速檢測。利用膠體金免疫層析試紙條能夠快速、準確檢測茶葉中草甘膦含量；以金黃色葡萄球菌菌體抗原免疫家兔獲得多克隆抗血清，膠體金免疫層析技術可以快速檢測金黃色葡萄球菌。利用馬鈴薯X病毒(PVX)和馬鈴薯Y病毒(PVY)的兔多克隆抗體，研制的膠體金試紙條可用于PVX和PVY的快速檢測，且靈敏度高、無交叉反應。

為建立高效、準確、便攜的煙草黑脛病菌現場檢測技術，筆者以煙草黑脛病菌為抗原制備單克隆抗體，以膠體金為標記材料研制膠體金免疫層析檢測卡，用于煙草黑脛病菌的現場檢測，旨在建立免疫膠體金層析檢測技術，可實現煙草黑脛病菌早期診斷和病害監測，對煙草黑脛病的早期預防具有重大意義。

1 材料與方法

供試菌株：煙草疫霉()，安徽農業大學植物保護學院保存。供試土樣：四川省宜賓市烤煙產區健康煙草根際土壤、煙草黑脛病病株根際土壤，每份約50 g，放入無菌樣品袋，于4 ℃保存備用。10%V8 培養基：取去離子水800 mL，分別加入100 mL V8 汁，CaCO0.2 g，瓊脂粉15 g，定容至1 L。試劑及儀器：牛血清白蛋白BSA、弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑，西格瑪奧德里奇(上海)貿易有限公司；其他試劑均為國產分析純。ST3100型pH計，奧豪斯儀器(上海)有限公司；恒溫培養振蕩器ZWY-2102C，上海智城分析儀器制造有限公司；臺式劃膜噴金機HGS510，杭州峰航科技有限公司。

單克隆抗體的制備。取6周齡雌性BALB/c小鼠4只進行免疫，共進行3次免疫，采取皮下多點注射，其中抗原免疫用量為25 μg。初次免疫用等量弗氏完全佐劑乳化，第二次免疫用等量弗氏不完全佐劑乳化，第三次免疫用等量生理鹽水混合，腹腔注射。第二次免疫后10 d尾靜脈采血，通過間接法測定抗體效價。

采用有限稀釋法將細胞懸液連續稀釋至統計上每孔加樣僅含單個細胞，轉移至96孔板培養，經過數次克隆化操作，直至所有克隆化細胞孔檢測陽性率為100%時，即可確定已獲得分泌單克隆抗體的雜交瘤細胞株。將獲得的陽性雜交瘤細胞在細胞培養瓶中擴大培養，而后凍存及制備腹水等。

將腹水離心15 min(4 000 r/min，室溫)，取上清，在4 ℃攪拌下逐滴緩慢加入飽和硫酸銨至半飽和，繼續攪拌30 min，離心30 min(13 000 r/min，4 ℃)，棄上清；沉淀溶于適量PBS(0.01 mol/L，pH 7.4)；在4 ℃攪拌下逐滴緩慢加入飽和硫酸銨至33%，繼續攪拌30 min，離心30 min(13 000 r/min，4 ℃)，棄上清；沉淀溶于適量PBS(0.01 mol/L，pH 7.4)，4 ℃透析過夜，測定抗體含量，-20 ℃凍存備用。硫酸銨沉淀后繼續采用Protein G小柱進行純化，新柱子先用5 mL超純水過柱，再用5 mL 0.4 mol/L PB緩沖液(pH 7.0)平衡純化小柱；抗體過柱，過程中要求緩慢過柱，以求抗體蛋白更好地結合在結合位點上；繼續10 mL 0.4 mol/L PB緩沖液(pH 7.0)平衡純化小柱；5 mL 0.1 mol/L甘氨酸-鹽酸緩沖液(pH 2.7)洗脫結合位點上的抗體，并加入1 mol/L Tris-HCl(pH 8.0)中和甘氨酸，使pH保持為適合抗體保存的中性。

抗體配對篩選。配對篩選應用雙抗夾心的ELISA方法對制備得到的抗體進行篩選，篩選出可以配對的抗體對。

雙抗夾心的ELISA：用包膜緩沖液將包被抗體稀釋至10 μg/mL，每孔100 μL，37 ℃包被3 h；洗板3～5次，每孔100 μL，25 ℃反應45 min；洗板3～5次，加入酶標抗體，每孔100 μL，25 ℃反應45 min；洗板3～5次，加入顯色劑，25 ℃避光反應15 min；加入100 μL終止液，測定OD。

單抗與單抗配對篩選：將單抗作為包被抗體，另一個單抗標記HRP之后作為檢測抗體，應用雙抗夾心的ELISA方法進行配對篩選。

抗體標記HRP：2 mg HRP溶于純水，加入高碘酸鈉，室溫反應30 min；將5 mg抗體用偶聯緩沖液透析過夜；將HRP加入抗體溶液中，室溫反應2 h；加入硼氫化鈉封閉反應位點；磷酸鹽緩沖液透析過夜，加入等量甘油保存于-20 ℃。

膠體金試紙的制備。

膠體金制備。取超純水于燒杯中，加入燒金溶液A，置于恒溫磁力攪拌器上攪拌混勻，開啟加熱至溶液沸騰，迅速加入新制備的燒金溶液B，繼續攪拌加熱，溶液逐漸變為藍黑色，然后紫黑，再加熱出現紅色，繼續沸煮出現透明的橙紅色，繼續沸煮7～10 min，自然冷卻至室溫，加超純水定容。倒入棕色瓶，4 ℃避光保存。

膠體金標記抗體。取1.5 mL膠體金，用0.1 mol/L的KCO調節pH，加入相應量抗體，混合均勻，室溫反應40 min。加入10%的BSA終止反應，靜置30 min。1 500 r/min離心，棄凝聚的金膠粒形成的沉淀，8 500 r/min離心30 min，棄上清，沉淀物用金標液復溶，4 ℃保存。

噴金與劃膜。將包被抗原稀釋至適當濃度劃于T線，羊抗鼠二抗劃于C線，烘干待用；標記好的膠體金噴于預處理過的金標墊，烘干待用。

組裝與測試。按圖1所示將速測試紙各個組分組裝，并檢測配對效果，不用編號的金標墊與膜兩兩組合，檢測配對效果。

注：1.底板；2.NC膜；3.吸水紙；4.金標墊；5.樣品墊；6.T線；7.C線 Note：1.Bottom plate；2.NC membrane；3.Absorbent paper；4.Gold standard pad；5.Sample pad；6.T line；7.C line圖1 膠體金試紙條組裝Fig.1 Assembling of colloidal gold test strip

試紙條靈敏度檢測。將煙草黑脛病菌菌絲分別稀釋為10、100、1 000倍的溶液，分別用試紙條進行檢測，每個處理重復3次。

田間樣品測試。將從四川省宜賓市采集的煙草樣本利用膠體金測速卡進行檢測。

煙草黑脛病菌膠體金速測卡定量檢測體系。將陽性樣品(10 μg/mL)梯度稀釋后用金標速測卡進行檢測，同時用呈色分析儀讀取C、T線深度值，重復3組，計算T/C的平均值，建立線性回歸方程。

2 結果與分析

以煙草疫霉的菌絲和孢子作為抗原，小鼠經4次免疫后，共獲得24個細胞株，純化后的抗體亞型主要為IgG1，其中單抗15和單抗24的抗體亞型為IgM；有22個抗體的效價達1∶128 000及以上，而單抗1和單抗15效價較低為1∶64 000。表明煙草黑脛病菌的單克隆抗體已制備成功，可用于后續抗體配對及膠體金免疫層析速測卡的研制(表1)。

表1 單克隆抗體亞型和效價Table 1 Antibody subtypes and titers

選擇13個煙草黑脛病菌的單克隆抗體進行抗體兩兩配對篩選，判斷能否形成穩定的雙抗體夾心結構。抗體配對篩選結果表明，金標單抗6配對劃膜單抗18，金標單抗16配對劃膜單抗14和18，金標單抗19配對劃膜單抗18，金標單抗22配對劃膜單抗12和單抗18均有明顯的陽性反應(較強陽性和強陽性反應)，篩選出能夠形成穩定的雙抗體夾心結構的抗體配對，可用于膠體金免疫層析試紙條的研制(表2和圖2)。

表2 抗體配對篩選Table 2 Antibody pairs screening

圖2 抗體配對篩選Fig.2 Antibody pairs screening

根據抗體配對篩選結果，選擇金標單抗6配對劃膜單抗18組裝膠體金免疫層析速測卡，用于檢測菌絲樣品，稀釋100倍后肉眼仍能夠在T線上看到顯色反應，而稀釋1 000倍后T線未呈現顯色反應，表明金標單抗6配對劃膜單抗18的最低檢測抗原濃度為0.1 μg/mL，有較高的檢測靈敏度(圖3)。

圖3 煙草黑脛病菌膠體金免疫層析速測卡的靈敏度Fig.3 Sensitivity of colloidal gold rapid detection card for Phytophthora nicotianae

為明確煙草黑脛病菌膠體金速測卡現場檢測效果，從田間采集健康煙株和發病植株進行檢測。所研制的煙草黑脛病菌膠體金速測卡能夠檢測出菌絲樣品和煙草黑脛病病根，T線呈現顯色反應，而對健康根、赤星病病葉和根黑腐病病根在T線未呈現顯色反應，表明煙草黑脛病菌膠體金速測卡特異性較高，可在田間實現黑脛病的早期檢測(圖4)。

圖4 煙草黑脛病菌膠體金免疫速測卡田間樣本檢測Fig.4 Detection of field samples by colloidal gold rapid detection card of Phytophthora nicotianae

同時，從田間采集10份發病材料，利用煙草黑脛病菌膠體金速測卡進行檢測，其中室內分離到的黑脛病菌和尖孢鐮刀菌分別是5和3份，膠體金速測卡檢出黑脛病菌7份，常規PCR檢出黑脛病菌9份。膠體金速測卡檢出率略低于PCR，但高于室內分離純化鑒定(表3)。

表3 田間發病樣品檢測Table 3 Detection of diseased tobacco

利用呈色分析儀分別讀取反應5、8、10 min后C線和T線深度值，并計算T/C，其T/C在5、8、10 min差異不大，因此最佳檢測時間可以選擇5 min(表4)。以稀釋倍數(即濃度的倒數)為橫坐標，T/C為縱坐標，得出標準曲線=-0049 5+1279 3(=0972 6)，可用于定量檢測樣品中的煙草黑脛病菌數量(圖5)。

表4 煙草黑脛病菌膠體金免疫層析速測卡T/C比值Table 4 The T/C ratio of colloidal gold rapid detection card for Phytophthora nicotianae

圖5 煙草黑脛病菌膠體金免疫層析速測卡定量檢測標準曲線Fig.5 Standard curve for quantitative detection of Phytophthora nicotianae with colloidal gold rapid detection card

3 結論與討論

煙草黑脛病是我國西南煙區主要的根莖類病害，煙草黑脛病的防治應采取“預防為主，綜合防治”的策略，煙草黑脛病的早期監測是有效控制該病害的重要前提。

目前，基于聚合酶鏈式反應(PCR)快速診斷已在植物病害檢測中廣泛應用，包括常規PCR、多重PCR、實時熒光定量PCR，然而存在檢測時間長、價格相對昂貴，且需要特殊的儀器設備和熟練的技術人員等方面的不足。近年來，又開發出多種基于核酸擴增的等溫快速檢測技術，如環介導等溫擴增技術(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)和重組酶聚合酶擴增技術(recombinase polymerase amplification，RPA)，已廣泛應用于植物病原菌的快速檢測，然而這2種技術都容易出現假陽性。

膠體金免疫層析技術具有簡單、快速、準確和無污染等優點，是以膠體金為示蹤標記物，與抗原抗體特異性反應相結合的免疫分析技術，現已廣泛應用于醫學檢驗、食品檢測和病原物檢測等領域，可實現定性、半定量以及定量檢測。膠體金免疫層析技術應用于植物病原物的現場快速檢測，如以番茄環紋斑點病毒(TZSV)的核殼體蛋白為抗原，建立的膠體金免疫層析檢測技術，檢測方便、快速、特異性強，其檢測下限是TZSV感染葉片的800倍稀釋液；以水稻條紋病毒(RSV)的病毒粒子為抗原制備單克隆抗體，建立的RSV膠體金免疫層析試紙條，特異性檢測水稻和灰飛虱中是否存在RSV，其靈敏度達 1∶20 480；以尖孢鐮刀菌一個65 kD蛋白為檢測靶標建立的膠體金免疫層析技術，其敏感性、特異性和準確性分別為92.59%、81.25%和90.00%，對染病根莖的檢測下限為2.122 μg/mL抗原，檢測時間只需要5 min。

該試驗使用煙草黑脛病菌的菌絲和孢囊孢子為抗原，制備單克隆抗體，研制煙草黑脛病菌膠體金免疫層析速測卡。所建立的煙草黑脛病菌膠體金免疫層析技術，其最大的優點是簡便、快速、不需要特殊的檢測儀器，通常只需5～10 min即可完成檢測；靈敏度高，其檢測下限為0.1 μg/mL抗原，能夠特異性檢測煙草黑脛病菌，沒有交叉反應，可應用于煙草黑脛病田間快速準確診斷，有較好的推廣和應用價值。