菌酶協(xié)同發(fā)酵對(duì)中草藥有效成分消化溶出率的影響

侍寶路，王梓旭，胡丹丹，王計(jì)偉

(安佑生物科技集團(tuán)股份有限公司，江蘇太倉(cāng) 215437)

我國(guó)擁有豐富的中草藥資源和幾千年的用藥歷史經(jīng)驗(yàn)。中草藥作為天然傳統(tǒng)藥物，富含多種活性物質(zhì)，具有綠色、安全、低殘留等特點(diǎn)，在畜牧業(yè)中被應(yīng)用于養(yǎng)殖動(dòng)物增強(qiáng)免疫、疾病防治和醫(yī)藥保健。中草藥有效成分多分布于植物細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞間隙，新鮮藥材經(jīng)干燥后，細(xì)胞逐漸萎縮，活性物質(zhì)呈結(jié)晶或無(wú)定形狀態(tài)沉積于細(xì)胞內(nèi)，細(xì)胞質(zhì)膜的半透性喪失，導(dǎo)致胞內(nèi)物質(zhì)溶出障礙。植物細(xì)胞壁主要是由纖維素、半纖維素、果膠質(zhì)等大分子構(gòu)成，而常見的超聲波萃取技術(shù)、超臨界流體萃取技術(shù)、酶提取技術(shù)等中草藥提取技術(shù)均是通過(guò)破壞植物細(xì)胞壁，讓中草藥有效成分與溶劑接觸并溶出提取的過(guò)程。發(fā)酵中藥的本質(zhì)是利用微生物生長(zhǎng)代謝過(guò)程中產(chǎn)生的酶類消化植物細(xì)胞壁，釋放活性物質(zhì)，提高藥效，降低藥物副作用，產(chǎn)生新的生物活性物質(zhì)，達(dá)到中草藥與益生菌協(xié)同增效的效果。

王不留行為石竹科植物麥藍(lán)菜[(Neck.)Garcke]的干燥成熟種子，具有行血通經(jīng)、催生下乳、消腫斂瘡的功效；益母草為唇形科植物益母草(Houtt.)的新鮮或干燥地上部分，具有活血調(diào)經(jīng)、利水消腫、清熱解毒的功效；甘草為豆科多年生草本植物，具有補(bǔ)氣、止咳、清熱解毒、止痛等功效。日糧中添加王不留行可以提高哺乳母豬泌乳性能和抗氧化能力；益母草和甘草在母豬繁殖性能方面發(fā)揮有益作用。有研究發(fā)現(xiàn)，中草藥經(jīng)益生菌發(fā)酵后有效活性成分含量增加；劉洋等研究發(fā)現(xiàn)，王不留行和益母草經(jīng)乳酸菌和酵母菌發(fā)酵后，可溶性總黃酮、總生物堿、粗多糖和總皂苷含量分別比未發(fā)酵組提高了55.14%、127.28%、55.42%和49.21%。目前，在生物酶法輔助提取中藥方面，研究較多的是非淀粉多糖酶，尤其是纖維素酶。前人對(duì)發(fā)酵中草藥成分含量變化的研究，多使用有機(jī)溶劑萃取發(fā)酵前后的中草藥樣品，檢測(cè)活性成分含量，但此方式并不能代表其活性成分的消化溶出效果。該研究通過(guò)篩選益生菌和纖維素酶并進(jìn)行仿生消化處理，評(píng)估菌酶協(xié)同發(fā)酵對(duì)中草藥有效成分消化溶出率的影響，為發(fā)酵中草藥應(yīng)用于母豬生產(chǎn)提供研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

試劑。氯化鈉、氯化鉀、無(wú)水磷酸氫二鈉、無(wú)水磷酸二氫鈉、胃蛋白酶(sigma，P7000)、淀粉酶(Sigma，A3306)、胰蛋白酶(Amersco，0785)、糜蛋白酶(Amersco，0164)；王不留行黃酮苷標(biāo)準(zhǔn)品(批號(hào)111853-201704，含量96.9%，購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院)；甲醇、磷酸為色譜純，其余試劑均為分析純。

菌種。植物乳桿菌()、產(chǎn)氣莢膜梭菌ATCC13142，均為安佑微生物研究所微生物實(shí)驗(yàn)室甘油管保存。酵母菌：安佑微生物研究所菌種庫(kù)釀酒酵母菌7株，編號(hào)分別為J1、J2、J3、J4、J5、J6、J7，均為安佑微生物研究所微生物實(shí)驗(yàn)室甘油管保存。非淀粉多糖酶：木聚糖酶，10萬(wàn)U/g，購(gòu)自武漢新華揚(yáng)生物股份有限公司；纖維素酶M1、M2、M3和M4，均選購(gòu)自市場(chǎng)。

原料。玉米粉均為市售，粉碎備用。中草藥組方：王不留行、益母草、甘草按4∶3∶3混合，以上中草藥均購(gòu)自亳州藥材市場(chǎng)，為飼料級(jí)，按上述配方比例混合，粉碎過(guò)40目篩，備用。

培養(yǎng)基。乳酸菌培養(yǎng)基：MRS液體培養(yǎng)基；芽孢桿菌培養(yǎng)基：牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基；酵母菌培養(yǎng)基：馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基。固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基：按“..”所述中藥組方配制中藥，將中藥和玉米粉按8∶2混合均勻，作為固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基。

酵母菌篩選。將7株酵母菌甘油管接種于馬鈴薯葡萄糖平板上，28 ℃靜置培養(yǎng)2 d，挑較大菌落轉(zhuǎn)接于馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基中，在溫度30 ℃、轉(zhuǎn)速100 r/min的恒溫?fù)u床上振蕩培養(yǎng)24 h，得培養(yǎng)液，檢測(cè)活菌數(shù)。將培養(yǎng)液在8 000 r/min下離心30 min，棄除沉淀，保留上清液，以產(chǎn)氣莢膜梭菌ATCC13142作為指示菌，采用打孔法進(jìn)行抑菌試驗(yàn)，測(cè)量抑菌圈直徑。每個(gè)菌株進(jìn)行3個(gè)重復(fù)，以活菌數(shù)和抑菌圈直徑為標(biāo)準(zhǔn)篩選出發(fā)酵效果較好的酵母菌。

發(fā)酵種子液制備。將“..”中篩選出的酵母菌接種至馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基，枯草芽孢桿菌接種至牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基，在溫度30 ℃、轉(zhuǎn)速100 r/min的恒溫?fù)u床上振蕩培養(yǎng)24 h，作為酵母菌和枯草芽孢桿菌種子液。植物乳桿菌接種至MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃靜置培養(yǎng)12 h，備用。

非淀粉多糖酶使用。將酵母菌、枯草芽孢桿菌和植物乳桿菌的種子液、木聚糖酶和纖維素酶M1、M2、M3、M4在水中充分溶解，作為發(fā)酵菌液與固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基混合，物料發(fā)酵初水分約為40%，酵母菌、植物乳桿菌和木聚糖酶在物料中的接種濃度分別為1.0×10CFU/g、1.0×10CFU/g和3 000 U/kg，纖維素酶M1、M2、M3和M4在物料中的接種濃度均為2 000 U/kg。分裝至帶呼吸閥的發(fā)酵袋密封，37 ℃靜置發(fā)酵5 d，測(cè)定發(fā)酵后物料中水分、總酸和中性洗滌纖維(NDF)含量，以發(fā)酵前樣品為空白對(duì)照組，計(jì)算NDF降解率，每個(gè)處理進(jìn)行3個(gè)重復(fù)，篩選出效果較好的纖維素酶。

體外消化處理。參考廖睿等和Regmi等方法，略有改動(dòng)，具體如下：

(1)胃緩沖液。稱取2.59 g氯化鈉和0.25 g氯化鉀，加350 mL去離子水溶解，用2 mol/L的鹽酸在39 ℃下調(diào)節(jié)pH至2.0，冷卻后將上述溶液轉(zhuǎn)入500 mL容量瓶中定容。

(2)小腸緩沖液。稱取0.52 g無(wú)水磷酸氫二鈉、2.57 g無(wú)水磷酸二氫鈉和青霉素12萬(wàn)U，加40 mL去離子水溶解，39 ℃下用磷酸(1 mol/L)或氫氧化鈉(1 mol/L)調(diào)節(jié)pH至6.30，冷卻后轉(zhuǎn)入50 mL容量瓶中定容。

(3)模擬胃液(胃蛋白酶活性737.5 U/mL)。稱取胃蛋白酶147.5 kU，溶解于200 mL pH 2.0的胃緩沖液中，緩慢攪拌至溶解，臨用前配制。

(4)模擬小腸液。稱(量)取淀粉酶41.41 kU、胰蛋白酶12.82 kU、糜蛋白酶1.62 kU，溶解于17 mL去離子水中，緩慢攪拌至溶解15 min以上，臨用前配制。

稱取發(fā)酵前后樣品1 g(精確到0.001 g)于圓底燒瓶中，加入10 mL模擬胃液，39 ℃水浴消化4 h；加入6 mL小腸緩沖液、1.6 mL模擬小腸液，39 ℃水浴消化16 h；將未消化的殘?jiān)占闉V裝置中，使用已稱重的定量濾紙過(guò)濾，并使用去離子水清洗；將殘留物與濾紙一起在(103±2)℃下烘至絕干，稱重，每個(gè)處理進(jìn)行3個(gè)重復(fù)，測(cè)定消化處理前后樣品中王不留行黃酮苷含量。

常規(guī)指標(biāo)檢測(cè)。飼料中的水分、總酸和粗蛋白質(zhì)含量測(cè)定分別按照GB/T 6435—2014、GB/T 6432—1994和GB/T 12456—2008 方法；中性洗滌纖維(NDF)和酸性洗滌纖維(ADF)參照 Van Soest 等方法進(jìn)行測(cè)定；pH采用PHS-3C型酸度計(jì)直接測(cè)定。乳酸菌總數(shù)和酵母菌總數(shù)測(cè)定分別參照 GB 4789.35—2016和GB 4789.15—2016方法。

王不留行黃酮苷含量測(cè)定。

對(duì)照品溶液的制備。取王不留行黃酮苷對(duì)照品適量，精密稱定，加70%甲醇制成每1 mL含0.1 mg的溶液，即得。

供試品溶液的制備。取發(fā)酵前后樣品(過(guò)三號(hào)篩)約1.2 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入70%甲醇50 mL，稱定重量，超聲處理(功率250 W，頻率33 kHz)30 min，放冷，再稱定重量，用70%甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

測(cè)定方法。參照《中國(guó)藥典》2015年版方法，其中，色譜柱為Agilent HC-C柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流速1 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)280 nm，柱溫30 ℃，進(jìn)樣量10 μL。測(cè)定消化處理前后樣品中王不留行黃酮苷含量，每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)，計(jì)算出王不留行黃酮苷消化溶出率，并對(duì)比發(fā)酵前后王不留行黃酮苷含量的變化。

式中，為消化前樣品質(zhì)量(g)；為消化前樣品中王不留行黃酮苷含量(mg/kg)；為消化后樣品質(zhì)量(g)；為消化后樣品中王不留行黃酮苷含量(mg/kg)。

2 結(jié)果與分析

從表1可以看出，酵母菌J2、J3和J6 對(duì)產(chǎn)氣莢膜梭菌ATCC13142具有殺菌作用，其他酵母菌株無(wú)抑菌效果，綜合考慮，選用抑菌效果較好的酵母菌J3作為發(fā)酵菌株。

從表2可以看出，與發(fā)酵前CK組相比，發(fā)酵原料經(jīng)37 ℃靜置發(fā)酵5 d后，纖維素酶M3的總酸含量和NDF降解率分別為3.14%和 10.01%，為發(fā)酵效果較好的纖維素酶產(chǎn)品。

表1 酵母菌篩選試驗(yàn)Table 1 Yeast screening test

表2 非淀粉多糖酶篩選Table 2 Screening of non-starch polysaccharide enzymes %

從發(fā)酵前后王不留行黃酮苷的體外消化溶出率(表3)可以看出，經(jīng)發(fā)酵后，王不留行黃酮苷消化溶出率略升高，消化溶出率由94.55%提升至96.46%。

表3 發(fā)酵前后王不留行黃酮苷消化溶出率比較Table 3 Comparison of the digestion and dissolution rate of flavonoid glycosides in Vaccaria segetalis before and after fermentation

3 討論

釀酒酵母作為常見的益生菌，具有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，以干性活酵母、酵母細(xì)胞壁、酵母核苷酸等產(chǎn)品形式應(yīng)用于畜牧養(yǎng)殖中。該試驗(yàn)中，有3組釀酒酵母菌培養(yǎng)液對(duì)產(chǎn)氣莢膜梭菌ATCC13142有明顯的抑菌效果，表現(xiàn)出殺菌特性。酵母菌的殺菌特性主要?dú)w因于兩方面：一是營(yíng)養(yǎng)競(jìng)爭(zhēng)，二是產(chǎn)有機(jī)酸、乙醇、分泌毒素蛋白、過(guò)氧化氫等抑菌物質(zhì)。毒素蛋白是一種分泌的胞外蛋白或糖蛋白，它會(huì)破壞敏感菌的細(xì)胞膜，殺菌酵母常用于食品保鮮。在母豬飼糧中添加適量釀酒酵母，可改善母豬體況，縮短產(chǎn)仔和發(fā)情間隔，提高初乳品質(zhì)，改善母豬腸道健康，顯著降低哺乳期間仔豬腹瀉率和死亡率。因此，從發(fā)酵料的酵母菌總數(shù)和抑菌效果綜合考慮，確定釀酒酵母J3作為發(fā)酵中草藥的酵母菌株。

中草藥的生物酶解輔助提取法是利用酶反應(yīng)的催化活性和高度專一性等特點(diǎn)，選擇相應(yīng)的生物酶，水解植物細(xì)胞壁中纖維素、半纖維素、果膠質(zhì)等物質(zhì)，以促進(jìn)有效成分?jǐn)U散溶解的方法，干燥植物體中近50%為纖維素，纖維素酶發(fā)揮重要作用。纖維素酶是能將纖維素水解的酶的總稱，是一類復(fù)雜酶體系總稱，主要包括內(nèi)切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶，常用濾紙酶活(FPA，filter paper activity)作為生化轉(zhuǎn)化的應(yīng)用指標(biāo)，其中外切纖維素酶是最關(guān)鍵的限制性單酶因子，作用機(jī)理：內(nèi)切葡聚糖酶主要作用于纖維素的非結(jié)晶區(qū)，將纖維素長(zhǎng)鏈降解為小分子纖維素或寡糖鏈；外切葡聚糖酶又稱作纖維二糖水解酶，與內(nèi)切葡聚糖酶協(xié)同作用于纖維素的結(jié)晶區(qū)，將纖維素鏈剝離并水解β-1，4-糖苷鍵釋放纖維二糖，經(jīng)β-葡萄糖苷酶水解成葡萄糖。植物纖維中木聚糖在纖維素酶作用于纖維素時(shí)形成了一定的空間位阻效應(yīng)，木寡糖對(duì)于纖維素酶具有一定程度的抑制作用，因此，該試驗(yàn)使用木聚糖酶能夠提高纖維素酶解效率，降低纖維素酶的使用量。該試驗(yàn)條件下，纖維素酶M3組降解NDF效果較好，且總酸含量較高，表明與其他組相比，纖維素酶M3中各成分酶組成較為合適，具體還需進(jìn)一步研究。該試驗(yàn)中各組纖維素酶對(duì)NDF含量降解效果有限，可能原因是王不留行、益母草和甘草均為草本植物，生長(zhǎng)后期木質(zhì)化程度較高，木質(zhì)素限制水解酶接近多糖底物，以及通過(guò)非選擇性吸附使酶失活，從而限制酶解效果。

基于體外酶法的體外消化技術(shù)一直作為動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)研究的重要手段之一。田樹海等研究發(fā)現(xiàn)，不同中草藥的干物質(zhì)體外消化率有很大差異；陳皮和枳殼纖維含量高，干物質(zhì)消化率較低，應(yīng)該使用提取物；當(dāng)歸、黨參中纖維含量少，干物質(zhì)消化率較高，可以直接添加到日糧中。該試驗(yàn)條件下，王不留行黃酮苷體外消化溶出率均很高，表明王不留行可直接添加到日糧中飼喂，添加纖維素酶和木聚糖酶后經(jīng)乳酸菌和酵母發(fā)酵，對(duì)王不留行黃酮苷消化溶出率有一定促進(jìn)作用，中草藥混合物中其他有效成分消化溶出率變化情況有待進(jìn)一步試驗(yàn)研究。

4 結(jié)論

該試驗(yàn)將王不留行、益母草和甘草按4∶3∶3混合成中草藥原料，添加玉米粉作為輔料，以產(chǎn)氣莢膜梭菌ATCC13142作為指示菌，篩選出釀酒酵母J3的殺菌效果最佳，纖維素酶M3降解 NDF效果較好，降解率為10.01%。發(fā)酵原料含水量為40%，植物乳桿菌和釀酒酵母J3分別接種1.0×10和1.0×10CFU/g，纖維素酶M3和木聚糖酶的添加量分別為2 000 和3 000 U/kg時(shí)，37 ℃發(fā)酵5 d后，王不留行黃酮苷體外消化溶出率由94.55%提升至95.66%，可直接用于母豬日糧中。