電子束輻照對大黃品質及抗氧化活性的影響

付 孟 王 丹,* 何 毅 王 鋼 唐藝文 于 明 高 鵬 黃 敏

(1 西南科技大學生命科學與工程學院，四川 綿陽 621010； 2 四川原子能研究院，四川 成都 610101；3 輻照保藏四川省重點實驗室，四川 成都 610101)

大黃別名黃良、生軍、壯大黃、川軍，為蓼科植物掌葉大黃(RheumpalmatumL.)、唐古特大黃(RheumtanguticumMaxim. ex Balf.)或藥用大黃(RheumofficinaleBaill.)的干燥根[1]。大黃味苦性寒，是我國一種歷史悠久的傳統中藥材，具有瀉下、清熱、止血散瘀、保肝利膽、抗菌、抗腫瘤、預防糖尿病等作用[2]。目前，已從大黃中分離得到超過248種成分，主要生物活性成分為蒽醌類，包括蘆薈大黃素(aloe-emodin)、大黃酸(rhein)、大黃素(emodin)、大黃酚(chrysophanol)、大黃素甲醚(physcion)等[3]，蒽醌類成分常作為大黃的質量控制指標。此外，還有蒽酮類、二苯乙烯類、苯丁酮類、色原酮類等生物活性成分[4]。大黃的根莖較大，干燥困難，在貯藏過程中容易出現蟲害、氣味散失、霉變、變色等現象。目前，市售大黃的貯藏加工方式多為曬干、陰干和硫磺熏蒸處理，但曬干和陰干處理效率較低，硫熏會導致藥材化學成分改變[5]，且常存在濫熏、過量熏蒸、重復熏蒸等情況。近年來，一些新型處理技術被用于中藥材的貯藏保存，但同樣存在一定的局限性，例如低溫處理技術效率低、過程控制比較困難[6]，遠紅外貯藏技術僅適用于少量貴重藥材的儲存[7]，微波處理技術可能會導致某些熱敏性成分被破壞[8]。因此，大黃的采后貯藏和加工技術落后成為了限制大黃產業發展的重要因素。

中藥由于其獨特的生長特性，在采收、干燥、炮制加工及貯藏等環節中易感染微生物，造成藥材變質、腐敗等問題[9]。輻照技術作為一種綠色、高效的殺菌技術，能最大限度地保持中藥材的性狀、活性成分含量及藥理活性[10]，在中藥材貯藏加工方面的應用越來越受到關注。王趙[11]采用60Co-γ射線輻照處理大黃，結果表明輻照對大黃的主要活性成分、指紋圖譜均無顯著影響。除了60Co可作為輻照源以外，高能電子束輻照在近年來也受到廣泛關注。與γ射線輻照相比，高能電子束輻照技術投入成本更低、安全性更強、加工效率更高、射線利用率更高、操作更簡單[12]。隨著高能電子束輻照技術的不斷發展完善，特別是高能電子加速器(10 MeV)的研發和推廣[13]，其在各種農產品、副食產品的冷加工、滅菌、貯藏等方面的應用越來越廣泛。發布于2015年的《中藥輻照滅菌技術指導原則》[14]為高能電子束輻照技術的應用提供了參考和指導。

目前，輻照滅菌技術在大黃中的應用研究報道較少。李月梅等[15]以60Co-γ射線按中藥制劑常規劑量(≤10 kGy)輻照大黃飲片，研究大黃飲片中5種成分在輻照前后以及貯藏6個月后的含量變化，結果表明輻照后大黃飲片中蘆薈大黃素、大黃素甲醚、大黃素、大黃酚、大黃酸含量均有所下降，貯藏6個月后，雖然大黃飲片中主要成分有所降低，但輻照組大黃飲片中主要成分的穩定性較未輻照組有所增強；陳金月[16]利用薄層層析、紫外吸收光譜等方法研究60Co-γ射線輻照對大黃的影響，結果表明6 kGy以下輻照對大黃主要成分無顯著影響；王趙[11]對比了硫磺熏蒸和輻照滅菌對大黃的影響，結果表明輻照對大黃主要成分無顯著影響，相對于硫磺熏蒸，輻照滅菌是一種更為安全的方式。但高能電子束輻照技術在大黃飲片的應用研究尚鮮見報道。本研究以川產道地大黃藥材為試驗材料，利用高能電子束輻照處理，以未處理組和硫磺熏蒸組為對照，綜合評估不同高能電子束輻照劑量(2、3、5、7、10、13、15、25 kGy)處理下，大黃中微生物含量、理化性質、活性成分、抗氧化活性的變化，旨在探究適宜大黃的貯藏處理方式，為高能電子束輻照在大黃貯藏加工中的應用提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與試劑

大黃飲片購自四川省中興藥業有限公司，產于四川阿壩，規格凈制(一級)，批號181001，袋裝1.0 kg/袋，經西南科技大學侯大斌教授鑒定為掌葉大黃(RheumpalmatumL.)的干燥根莖。

蘆薈大黃素(純度98%)、大黃酸(純度98%)、大黃素(純度98%)、大黃酚(純度98%)、大黃素甲醚(純度98%)標準品，均購自成都埃法生物科技有限公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH)、甲醇，色譜純，購自賽默飛世爾科技(中國)有限公司；磷酸、無水乙醇，分析純，購自成都市科隆化學品有限公司。

1.2 試驗儀器

5804R高速離心機，德國Eppendorf公司；GH6000隔水培養箱，天津市泰斯特儀器有限公司；GE60DA高壓蒸汽滅菌鍋，美國致微公司；DHG-9123A干燥箱，上海申賢恒溫設備廠；IS1020高能電子加速器，同方威視科技(北京)有限公司；UltiMate3000DGLC，雙三元、二維液相色譜儀系統，美國賽默飛世爾公司；SPECORD 200PLUS紫外-可見分光光度計，德國Analytik Jena公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 樣品輻照處理 大黃飲片采用聚乙烯自封袋(20 cm×30 cm，30絲)封裝，每袋約400 g，鋪平厚度約4 cm。樣品送至四川潤祥輻照技術有限公司，采用劑量率約為260 Gy·s-1的高能電子加速器(VF-ProAcc-10/20，10 MeV，20 kW)進行雙面輻照處理。設定劑量為2、3、5、7、10、13、15、25 kGy，以未輻照樣品(control check, CK)和硫磺熏蒸處理的樣品為對照，每組均設置3個重復組。輻照后樣品于室溫避光貯藏，按《中華人民共和國藥典》[1]2020版藥材和飲片取樣法(通則 0211)分別于輻照后第0、第180、第360天取樣檢測。

1.3.2 大黃樣品微生物數量的測定 大黃飲片需氧菌總數(total aerobic microbial count，TAMC)采用培養基稀釋法測定，霉菌和酵母菌總數(total combined yeasts and molds count，TYMC)參照李東嫻等[17]的方法按平板涂布法進行檢測。TAMC、TYMC含量檢測結果以log CFU·g-1表示，大腸埃希氏菌(Escherichiacoli)參照《GB 4789. 38-2012食品微生物學 檢驗大腸埃希氏菌計數》[18]進行測定，沙門氏菌(Salmonella)參照《GB 4789. 4-2016食品微生物學檢驗沙門氏菌檢驗》[19]進行測定。

1.3.3 大黃樣品理化品質的測定 大黃樣品粉碎，過二號篩(24目)，按照《中華人民共和國藥典》2020版[1]大黃項下規定測定其水分(干燥失重)、總灰分及水溶性浸出物含量。

1.3.4 大黃樣品活性成分的測定 大黃5種游離蒽醌類物質含量按《中華人民共和國藥典》2020版[1]大黃項下規定的方法測定。

1.3.5 大黃樣品抗氧化活性的測定 參照Khanzadi等[20]的方法。檢測大黃甲醇提取物中DPPH自由基清除能力。

1.4 數據處理

試驗結果均以平均值±標準差(mean ± SD)表示，用SPSS 25進行方差分析，采用Duncan′s 多重比較分析是否有顯著差異(P<0.05表示差異顯著)，由Origin 2017繪制圖形。

2 結果與分析

2.1 高能電子束輻照對大黃貯藏期內微生物數量的影響

《中華人民共和國藥典》2020版[1]通則1108中藥飲片微生物限度檢查法中規定，直接口服及泡服飲片中需氧菌總數不得超過5 log CFU·g-1， 霉菌和酵母菌總數不得超過3 log CFU·g-1。由表1可知，大黃飲片在不同處理及不同貯藏時間內均未檢出大腸埃希氏菌和沙門氏菌。貯藏0 d時，CK組大黃微生物數量處于較高水平，TAMC、TYMC數量分別為6.08、5.38 log CFU·g-1，超過藥典規定限度。經硫磺熏蒸處理后，微生物數量有所下降，但仍超過現行藥典對直接口服及泡服飲片微生物限度的規定。高能電子束輻照處理能降低大黃中微生物的數量，延長大黃的貯藏期。當輻照劑量達到3 kGy及以上時，微生物數量均降至檢測限以下，符合現行藥典要求。

隨著貯藏時間延長，大黃微生物數量總體呈下降趨勢，但CK組的微生物數量仍超過藥典要求。輻照組大黃微生物數量在貯藏期內變化較小，2 kGy輻照處理的大黃TAMC、TYMC數量變化不明顯，3 kGy和5 kGy輻照后貯藏期內檢測出少量微生物，而經≥7 kGy劑量輻照處理后貯藏期內未檢出微生物。由此可見，當輻照劑量達到3 kGy及以上時，輻照能有效降低大黃中微生物數量，在360 d的貯藏期內微生物數量均控制在藥典規定以下。

表1 高能電子束輻照對大黃貯藏期內微生物數量的影響Table 1 Effects of the electron-beam irradiation treatment on microbial loads of Rheum palmatum L. during its storage /(log CFU·g-1)

2.2 高能電子束輻照對大黃貯藏期內理化性質的影響

《中華人民共和國藥典》2020版[1]規定，大黃飲片水分不得超過15.00%，總灰分不得超過10.00%。由表2可知，大黃干燥失重約為10.00%，總灰分含量約為5.50%，輻照對干燥失重和總灰分含量均無顯著影響。貯藏期內，隨貯藏時間延長，大黃干燥失重略有下降，而總灰分含量有所增加，但均符合藥典規定。

由表2可知，經高能電子束輻照處理后，大黃水溶性浸出物含量顯著增加。貯藏0 d時，CK組大黃水溶性浸出物含量為41.46%，2 kGy輻照時已顯著高于CK組。而硫熏處理后，其含量明顯降低。隨著貯藏期延長，大黃水溶性浸出物含量總體呈下降趨勢，但輻照組水浸物含量仍高于對照組和硫熏組。

2.3 高能電子束輻照對大黃貯藏期內活性成分含量的影響

取不同濃度對照品溶液，連續進樣考察各對照品濃度與高效液相色譜(high performance liquid chromatography, HPLC)圖峰面積的線性關系，得到線性回歸方程及線性范圍如下：蘆薈大黃素Y= 0.943 2X- 0.05 (R2= 0.999 9 )，1.578 ～ 15.78 μg·mL-1；大黃酸Y= 0.830 1X- 0.103 6 (R2= 0.999 7)，1.584 ～ 15.84 μg·mL-1；大黃素Y= 0.672 7X- 0.010 9 (R2= 0.999 9)，1.584 ～ 15.84 μg·mL-1；大黃酚Y= 1.107 9X- 0.014 5 (R2= 0.999 9)，1.606 ～ 16.06 μg·mL-1；大黃素甲醚Y= 0.811 4X+ 0.122 8 (R2= 0.999 6)，0.782 ～ 7.82 μg·mL-1。由圖1可知，5種蒽醌類化合物色譜峰分離較好，峰內無雜質干擾，在各自的線性范圍內線性關系良好。

表2 高能電子束輻照對大黃貯藏期內理化性質的影響Table 2 Effects of the electron-beam irradiation treatment on physicochemical properties of Rheum palmatum L. during its storage

注：A：對照品；B：樣品；1：蘆薈大黃素；2：大黃酸；3：大黃素；4：大黃酚；5：大黃素甲醚。Note: A: Standards. B: Sample. 1: Aloe-emodin. 2: Rhein. 3: Emodin. 4: Chrysophanol. 5: Physcion.圖1 大黃HPLC圖Fig.1 HPLC chromatogram of Rheum palmatum L.

蒽醌類化合物為大黃藥效的主要成分之一。由圖2-A可知，經高能電子束輻照后，大黃蒽醌類成分含量略有上升，主要體現在大黃酚含量增加，而對其他成分影響不大。隨輻照劑量增加，大黃酚含量先升高后趨于平穩，當輻照劑量達到25 kGy時，其含量呈下降趨勢。其他4種蒽醌類成分經15 kGy及以下劑量輻照后，其含量變化不明顯，在25 kGy時，也表現出下降趨勢。

由圖2-B可知，經360 d貯藏后，大黃蒽醌類成分整體明顯下降。輻照處理的大黃蒽醌類成分含量高于CK組，且總體上隨輻照劑量增加而略有上升，而硫熏處理組大黃蒽醌類成分含量略低于CK組和輻照組。由此可見，大黃蒽醌類成分含量隨貯藏時間延長明顯下降，高能電子束輻照處理有利于保持大黃貯藏期內主要活性成分含量。

注：A：貯藏第0天；B：貯藏第360天。Note: A:Storage day 0. B:Storage day 360.圖2 高能電子束輻照對大黃貯藏期內蒽醌類成分含量的影響Fig.2 Effects of the electron-beam irradiation treatment on the anthraquinones of Rheum palmatum L. during its storage

2.4 高能電子束輻照對大黃抗氧化活性的影響

由圖3可知，不同劑量輻照和硫熏處理對大黃DPPH自由基清除率無顯著影響(P>0.05)，且貯藏期內，其DPPH自由基清除率無明顯變化。表明高能電子束輻照及貯藏時間對大黃抗氧化活性影響不大。

圖3 高能電子束輻照對大黃貯藏期內DPPH自由基清除活性的影響Fig.3 Effects of the electron-beam irradiation treatment on the DPPH of Rheum palmatum L. during its storage

3 討論

3.1 高能電子束輻照對大黃貯藏過程中微生物數量的影響

本研究中，高能電子束輻照能降低大黃中微生物數量，當輻照劑量達到3 kGy及以上時，微生物數量均降至檢測限度以下，達到現行藥典要求。隨貯藏時間的延長，大黃中微生物數量略有下降，其原因可能與貯藏過程中干燥的環境以及藥材自身的理化性質有關[21]。李奉勤等[22]利用60Co-γ射線輻照三黃片中大黃粉，結果顯示適宜輻照劑量為2 kGy；白羽辛等[23]對人參粉進行輻照處理，結果發現達到預期滅菌效果的輻照劑量為6 kGy。與本試驗結果有所不同，其原因可能是初始微生物負載不同。蔡汶莉[24]用電子束輻照百合和山銀花藥材，結果表明兩種藥材的初始含菌值不同，相同輻照劑量下的滅菌效果不同，表明適宜的輻照劑量不同。Khawory等[25]研究也表明，爪葉洋茱萸、灌狀買麻藤、非洲楝的適宜輻照劑量為9～13 kGy，而其葉提取物的適宜輻照劑量為6～12 kGy。表明樣品初始微生物負載越高，其適宜的殺菌劑量越大。

3.2 高能電子束輻照對大黃理化品質的影響

中藥飲片浸出物是衡量中藥優劣的重要指標。王寧寧[26]研究表明，以水溶性浸出物作為評判山藥飲片質量等級的主要指標是可靠的。王薛等[27]也將水溶性浸出物作為評價藏邊大黃質量的標準之一。在《中華人民共和國藥典》[28]中收錄的以大黃為主要成分的水煎劑多達28種，可見大黃水浸物含量是評價大黃質量的一項重要指標。本研究中大黃飲片經不同劑量電子束輻照處理后，大黃水溶性浸出物顯著增加，增幅與輻照劑量總體呈正相關。蔡汶莉[22]報道了電子束輻照后百合藥材水溶性浸出物含量顯著增加，與本研究結果一致。其原因可能是輻照后蛋白質等大分子發生降解，產生如糖類化合物、有機酸、游離氨基酸等。隨著貯藏時間延長，大黃水溶性浸出物含量呈現下降趨勢，但輻照組的浸出物含量仍顯著高于對照組。李倩等[29]研究表明，大黃浸出物含量隨貯藏時間的延長有所降低，質量呈下降趨勢，與本研究結果一致。本研究中，電子束輻照后大黃水溶性浸出物含量顯著高于對照組及硫熏處理組，且對其干燥失重、總灰分含量無明顯影響，表明電子束輻照有利于保持貯藏期內大黃的品質，其效果明顯優于硫熏處理。

3.3 高能電子束輻照對大黃活性成分含量的影響

大黃蒽醌類化合物具有瀉下利尿、抗菌、抗病等多種作用，是藥典規定的大黃質量控制指標之一。本研究表明，電子束輻照后，蒽醌類化合物含量略有增加。王趙[11]采用60Co-γ射線和正電子輻照大黃，結果表明25 kGy以下劑量γ射線輻照對大黃蒽醌類成分無顯著影響，且兩種射線輻照對大黃指紋圖譜均無明顯影響。毛滕霄等[30]研究發現，30 kGy劑量以下60Co-γ射線輻照后，大黃總蒽醌、游離蒽醌含量無明顯變化。李月梅等[15]研究表明，大黃飲片中大黃素含量最高，經60Co-γ射線輻照后大黃飲片蒽醌類含量均有所下降，其中大黃素甲醚含量降幅最大，與本研究結果存在差異，原因在于不同產地大黃主要成分含量差異較大[31]。有研究表明，大黃中主要活性成分的含量與貯藏時間有關[32-33]。本研究中，貯藏第0天時，大黃蒽醌類成分隨著輻照劑量的增加，呈現先上升后下降的趨勢，可能是輻照促進大黃內蒽酮、蒽酚轉化為蒽醌，導致蒽醌類成分含量上升[29]。而蒽醌類成分易分解，且受溫度的影響較大[34]，隨著貯藏時間的增加，大黃活性成分含量降低。唐文文[35]研究發現，大黃在貯藏期內活性成分含量有所降低，可能是因為貯藏過程中的質量耗損，與本研究結果一致。本研究采用高能電子束對大黃飲片進行不同劑量輻照處理，結果表明高能電子束輻照在一定程度上能提高大黃中主要活性成分含量，且增加其貯藏過程中主要成分的穩定性，說明高能電子束輻照處理對大黃的貯藏具有積極作用。

3.4 高能電子束輻照對大黃抗氧化活性的影響

現代藥理研究表明，大黃主要對消化系統、保肝、腎臟等具有保護作用，還具有抗氧化、改善微循環等作用[36]。大黃所含的蒽醌類衍生物和鞣質等能對自由基引起的細胞損傷起到直接作用，有利于細胞抗衰老及機體修復，此外，大黃的抗氧化活性對于大黃的其他藥用成分發揮作用起著較強的輔助作用。因此，大黃的抗氧化活性是評價大黃品質的一個重要指標[37]。

王宇卿等[38]利用高效液相色譜-質譜儀(high performance liquid chromatography mass spectrometer, HPLC-MS)聯用檢測裝置分析大黃中抗氧化活性成分，在某種程度上客觀地評價了大黃的質量。Serhat等[39]報道了大黃提取物是良好的抗氧化劑，對DPPH自由基清除率、羥自由基清除率、超氧陰離子自由基清除率均高于抗氧化劑叔丁基羥基茴香醚(butyl hydroxy anisd,BHA)。袁詩俊等[37]研究表明，大黃60%乙醇提取物的DPPH自由基清除率最高，為96.02%。以上研究均表明，大黃具有良好的抗氧化活性，除傳統藥用外，在保健食品的開發研究方面也有廣闊的應用前景。

本研究表明，25 kGy及以下劑量電子束輻照、硫熏處理和貯藏時間對大黃DPPH自由基清除率均無明顯影響。呂慧英等[40]研究表明，大黃酚、大黃素甲醚與DPPH自由基清除能力呈負相關，而與大黃酸、蘆薈大黃素、大黃素DPPH自由基清除能力呈正相關。本研究僅探究了蒽醌類物質在貯藏期內的變化，5種成分含量在貯藏期內的變化可能導致大黃的抗氧化活性變化不顯著。且大黃的抗氧化活性不僅與蒽醌類成分相關，而且是大黃內所有抗氧化性物質共同作用的結果[41]，大黃內的鞣質類化合物和苷類化合物也會影響大黃的抗氧化活性，因此大黃抗氧化活性變化不顯著也可能是鞣質類化合物與苷類化合物的影響。何毅等[42]采用2、4、6 kGy高能電子束輻照川麥冬，結果表明高能電子束輻照對川麥冬抗氧化活性無顯著影響，與本研究結果類似。徐遠芳等[43]采用60Co-γ射線和電子束輻照對葛根提取物的研究也得到了類似的結果，即兩種射線輻照對葛根提取物的DPPH自由基清除率、羥自由基清除率及總還原力均無顯著影響。張玉等[44]采用1、2、3 kGy電子束輻照香菇，結果表明輻照對香菇DPPH自由基清除率無顯著影響。孫熙浛等[45]研究表明，5、10、30 kGy輻照劑量對紅景天提取物的DPPH自由基清除率、2，2′-聯氨-(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二氨鹽[2,2′-azinobis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid ammonium salt),ABTS]自由基清除率影響不大，與對照組相比均無顯著差異，與本試驗結果類似。在此研究基礎上，今后擬探究電子束輻照加工工藝，以期提高輻照加工效率，為電子束輻照在大黃上的應用提供依據。

4 結論

本研究結果表明，相比硫磺熏蒸，電子束輻照能有效延長大黃的貯藏期，且對大黃品質影響不大。當電子束輻照劑量達到3 kGy時能有效殺滅大黃中的微生物，輻照范圍在3～5 kGy時，微生物限度達到《中華人民共和國藥典》現行標準以下，同時大黃水浸物含量明顯增加，活性成分含量略有增加，適用于輻照后短期(約180 d)貯藏。當輻照劑量達到7 kGy時大黃中的需氧菌、霉菌和酵母在貯藏期內未檢出，7～10 kGy輻照處理能使微生物含量在一年的貯藏期內處于較低水平，且對其活性成分含量具有較好的保持作用，適用于輻照后長期(約360 d)貯藏。