氣調包裝協同低溫等離子體殺菌對獅子頭保鮮效果的影響

郭依萍 李 冉 葉可萍 李仲情 陳永芳 張園園

(南京農業大學食品科技學院國家肉品質量安全控制工程技術研究中心/江蘇省肉類生產與加工質量安全控制協同創新中心，江蘇 南京 210095)

隨著人們對高品質生活重視程度的提高，餐飲業在快節奏的生活中不斷變革，以現代餐飲業與食品加工業相融合的“中央廚房”也逐漸出現在大眾視野[1]。調理制品作為中央廚房生產的非終端產品[2]，主要通過適當加工后以包裝或散裝形式于低溫條件下配送至餐館、食堂等地進行儲存、銷售[3]，但由于食品本身營養物質及微生物的影響，產品貨架期較短，嚴重制約了調理制品的市場發展。獅子頭是肉丸的一種，屬于淮揚菜系，具有鮮香軟糯、肥瘦適中、食用方便等特點[4]，是深受廣大消費者喜愛的調理肉制品之一[5]。因獅子頭本身營養物質豐富，微生物極易在其表面及內部生長繁殖從而造成產品的腐敗變質[6]。傳統熱殺菌技術，如巴氏殺菌、高溫殺菌和超高溫瞬時滅菌等易損害食品的營養成分及感官品質[7]。此外，市場上銷售的獅子頭主要采用彩袋或塑料袋等進行簡單包裝，不利于獅子頭的貯藏銷售及遠距離運輸流通[8]。如何在保證產品品質的前提下有效延長產品貨架期，是制約獅子頭市場發展尤為關鍵的問題。

新型非熱殺菌技術，包括超高壓、低溫等離子體、超聲等，作為目前國際食品行業蓬勃發展的加工技術，已廣泛應用于果蔬、谷物、水產品、肉制品等領域[9]。肉及肉制品經非熱殺菌技術處理可以有效保持產品感官及食用品質，延長其貨架期[9-10]。低溫等離子體(cold plasma, CP)作為一種非熱殺菌技術，可以在常溫下通過電離氣體產生大量活性氧(reactive oxygen species, ROS)和活性氮(reactive nitrogen species, RNS)，從而抑制或殺滅產品表面的微生物[11]。與傳統熱處理滅菌方式相比，低溫等離子體技術具有處理溫度低、對營養破壞少、能最大限度保持產品品質、無毒副產品、成本低等優點[12]。由于其快速有效的殺菌特性，國內外學者已將其應用到多種食品的殺菌保鮮中，如生鮮果蔬、肉類及禽蛋制品[13]。Lee等[14]研究發現大氣壓低溫等離子體可以在不改變即食雞胸肉塊感官特性的同時顯著減少產品的細菌數量。馬虹兵等[15]研究表明低溫等離子可以有效殺滅橙汁和牛奶中的病原菌，且對維生素C及牛奶的氧化影響較小。氣調包裝(modified atmosphere packaging, MAP)通過在產品密封包裝前去除周圍的空氣，使用理想空氣(通常是混合氣體而不是單一類型的氣體)代替，從而達到抑制微生物生長繁殖的作用[16-17]。李冉等[8]研究表明，40%CO2+60%N2氣調包裝可以顯著抑制獅子頭中微生物的增長。汪春玲等[18]在氣調保鮮的基礎上結合低溫等離子體復合處理保鮮羅非魚片，發現在4℃條件下羅非魚的貯藏期可達到18 d，等離子體處理延緩了羅非魚的彈性驟變、揮發性鹽基氮的增長及微生物的生長繁殖。李天琪[19]研究表明低溫等離子體對氣調包裝的魷魚絲有明顯的殺菌效果，可以在保持即食魷魚絲品質的同時達到減少微生物的目的。上述研究表明，低溫等離子體對食品微生物有殺滅作用，與氣調包裝協同作用對延長產品貨架期有積極作用。但目前運用低溫等離子體技術對中式調理類肉制品的殺菌處理研究仍然較少，氣調包裝協同低溫等離子體作用的保鮮效果更有待探索。基于此，本試驗以獅子頭為研究對象，采用40%CO2+60%N2氣調包裝協同低溫等離子體殺菌的方式對樣品進行處理，優化低溫等離子體的處理時間，通過菌落總數、揮發性鹽基氮(total volatile base nitrogen, TVB-N)、硫代巴比妥酸反應物(thiobarbituric acid reactive substances, TBARS)、感官評價、揮發性有機化合物等指標，探究氣調包裝與低溫等離子體協同保鮮方式對獅子頭品質及貨架期的影響，旨在為獅子頭保鮮技術的發展提供理論參考，并促進中式調理類肉制品市場的發展。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

獅子頭產品購于江蘇省蘇食肉品有限公司，采樣前工廠已完成對樣品的微生物抽檢，將采集的獅子頭于3 h內用冰盒送至實驗室。

平板計數瓊脂(plate count agar, PCA)，北京陸橋技術股份有限公司；氧化鎂、硼酸、2-硫代巴比妥酸、三氯乙酸(trichloroacetic acid, TCA)，國藥集團藥業股份有限公司；甲基紅、溴甲酚綠指示劑，南京化學試劑股份有限公司；無菌均質袋，青島海博生物技術有限公司；氯化鈉，國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

PRACTUM612-1CN分析天平，德國賽多利斯公司；SMART500氣調包裝機，西班牙ULMA公司；TW20恒溫水浴鍋，德國Julabo公司；Avanti J-26 S XP高速冷凍離心機，美國Beckman Coulter公司；Scan 1200 自動影響分析菌落計數儀、BagMixer拍擊式均質器，法國InterScience公司；STARER3100型實驗室pH計，上海奧豪斯儀器有限公司；Spectral Max M2e 多功能酶標儀，美國MD公司；ICP500、ICP260培養箱，德國美墨爾特公司；K1160氣相離子遷移譜(gas chromatography-ion mobility spectrometry, GC-IMS)，濟南海能儀器股份有限公司；SJF-H6殺菌釜，山東鼎泰盛機械科技有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 樣品處理 將獅子頭樣品隨機分為5組，進行如下處理：第1組為對照組，不做任何處理，采用原有普通彩袋包裝；第2組為MAP組(40%CO2+60%N2組)，僅采用40%CO2+60%N2進行氣調包裝；另外3組作為低溫等離子體處理組，采用上述氣調包裝方式的同時利用低溫等離子體技術在85 kV電壓下分別處理3、6和9 min，標記為MAP-3 min、MAP-6 min和MAP-9 min。在采樣當天隨機選取經過不同處理后的樣品進行指標測定，記為第0天，其余樣品置于4℃條件下貯藏，每周取樣進行指標測定，直至樣品腐敗后停止試驗。重復次數為3。

1.3.2 測定項目與方法

1.3.2.1 菌落總數 菌落總數測定參照《GB 4789.2-2016食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 菌落總數測定》[20]。微生物數量表示為log CFU·g-1。細菌生長數據利用Baranyi方程擬合細菌的生長動力學模型[21-22]，并預測產品達到《NYT 2073-2011調理肉制品加工技術規范》[23]中預加熱類調理肉制品中細菌總數最高限量值5 log CFU·g-1的貯藏時間。

1.3.2.2 揮發性鹽基氮(TVB-N) TVB-N含量測定參照《GB 5009.228-2016食品安全國家標準 食品中揮發性鹽基氮的測定》[24]中的自動凱氏定氮法。

1.3.2.3 硫代巴比妥酸值(TBARS) 參考曹辰辰等[25]的方法并稍加修改。取5 g獅子頭樣品，加入25 mL 7.5%三氯乙酸[含0.1%乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid, EDTA)]，勻漿30 s后5 000 r·min-1離心10 min，取上清液2 mL，并加入2 mL 0.02 mol·L-12-硫代巴比妥酸溶液，95℃高溫孵育30 min后取出靜置冷卻至室溫。取上清液于532 nm波長處測定吸光度值。參考《GB 5009.181-2016 食品中丙二醛的測定》[26]中分光光度計法配制丙二醛標準系列溶液，并測定吸光度，制作標準曲線。TBARS值以每千克樣品中丙二醛(malondialdehyde, MDA)的毫克數表示。

1.3.2.4 感官評定 感官評定采用《GB/T 22210-2008食品安全國家標準 肉和肉制品感官評定規范》[27]并參考張志剛等[28]的研究方法，稍作修改。將貯藏后的獅子頭拿出恢復至室溫后，放置于白色陶瓷板上。由5位經過培訓的感官評價人員組成感官評價小組，通過觸覺、視覺和嗅覺檢驗對肉丸的色澤、外觀形態及氣味進行感官評價。每次感官評定在同一環境進行，評定人員之間無交流。感官評定標準見表1。

表1 獅子頭品質感官評定標準Table 1 Sensory evaluation standards of meatballs quality

1.3.2.5 揮發性有機化合物 采用GC-IMS分析獅子頭中的揮發性有機化合物，參考杜超等[29]的方法并稍加修改。稱取獅子頭樣品2 g置于20 mL頂空瓶中，磁帽密閉封口后放置在儀器進樣區待測。儀器采用振蕩加熱方式；60℃孵育15 min；孵育轉速500 r·min-1； 進樣針溫度85℃；進樣量500 μL。

GC條件：采用FS-SE-54-CB-1型色譜柱(15 m×0.53 mm，1 μm)，柱溫保持在60℃。以純度為99.99%的氮氣為載氣，載氣流速以2 mL·min-1保持2 min，8 min內線性增至15 mL·min-1， 10 min內增至 80 mL·min-1，15 min內增至130 mL·min-1， 最后5 min 增至150 mL·min-1。

IMS條件：漂移管溫度：45℃；漂移氣：N2；流速：150 mL·min-1；壓力：1.381 kPa；IMS探測器溫度：45℃。

1.4 數據處理

所有數據使用SAS分析軟件進行分析，采用單因素方差分析，使用Duncan’s多重比較進行顯著性差異分析，當P<0.05時，認為有顯著性差異。使用GraphPad Prism 8軟件繪圖。揮發性物質使用儀器配套軟件LAV(Laboratory Analytical Viewer)、GC×IMS Library Search進行定性分析，以信號峰體積表示揮發性有機物相對含量，數據以平均值±標準差形式表示。使用SPSS軟件對主成分特征值進行分析。

2 結果與分析

2.1 低溫等離子體處理對獅子頭貯藏過程中菌落總數的影響

由圖1-A可知，未經氣調包裝和低溫等離子體處理的對照組樣品初始菌落總數為4.25 log CFU·g-1。貯藏第0天，MAP組與對照組之間無顯著差異，經低溫等離子體處理后的獅子頭菌落總數可減少0.70～1.56 log CFU·g-1，顯著低于未經低溫等離子體處理組。貯藏7 d時，對照組樣品菌落總數達到5.31 log CFU·g-1， 超過《NYT 2073-2011調理肉制品加工技術規范》[23]中規定的預加熱類調理肉制品中細菌總數最高限量值(5 log CFU·g-1)，但MAP-6 min與MAP-9 min兩組的菌落總數還未達到4 log CFU·g-1， 顯著低于其他處理組。貯藏14 d時，對照組樣品菌落總數達6.84 log CFU·g-1，顯著高于其他處理組，MAP-9 min樣品菌落總數為4.91 log CFU·g-1，仍未超過調理肉制品菌落總數限量標準。隨貯藏時間延長，MAP-6 min與MAP-9 min兩組的菌落總數始終無顯著差異。如圖1-B、C所示，由Baranyi模型預測結果可知，對照組、MAP-6 min組及MAP-9 min組樣品菌落總數達到5 log CFU·g-1的時間分別為7.98、14.28、14.84 d 。由此表明，氣調包裝協同低溫等離子體處理可以有效降低獅子頭產品的初始細菌總數，在一定程度上延長了獅子頭產品的貨架期。

2.2 低溫等離子體處理對獅子頭貯藏過程中TVB-N含量的影響

TVB-N是指動物性食品由于酶和細菌的作用，在腐敗過程中使蛋白質分解而產生的氨以及胺類等堿性含氨物質，是表示食品新鮮度的指標[30]。由圖2可知，貯藏初期，經低溫等離子體處理后獅子頭的TVB-N含量與對照組之間無顯著差異。隨著貯藏時間的延長，各組TVB-N含量不斷增加，對照組的TVB-N含量顯著高于其他處理組。貯藏7 d時，MAP組與低溫等離子體處理組的獅子頭TVB-N含量無顯著差異。貯藏21 d時，對照組的TVB-N含量達到19.96 mg·100g-1， 對照組與MAP組的TVB-N含量均顯著高于低溫等離子體處理組。MAP-6 min和MAP-9 min兩處理組的TVB-N含量在貯藏過程中均無顯著差異，貯藏至28 d，TVB-N含量達到13.82～14.57 mg·100g-1。

2.3 低溫等離子體處理對獅子頭貯藏過程中TBARS值的影響

TBARS是脂質的氧化產物，表示產品的酸敗程度。TBARS值越大，表示產品脂質氧化程度越高[5]。由圖3可知，貯藏0 d時，經過低溫等離子體處理后的TBARS值顯著高于未經低溫等離子體處理組，表明低溫等離子體處理使脂質氧化的速度加快。但在貯藏14 d后，對照組的獅子頭TBARS值顯著高于其他處理組，MAP-6 min與MAP-9 min兩組之間無顯著差異。

2.4 低溫等離子體處理對獅子頭貯藏過程中感官品質的影響

由圖4可知，貯藏前7 d，各組獅子頭均可保持較好的色澤、氣味等感官品質。貯藏14 d時，各組獅子頭氣味指標評分均有所下降，但感官品質整體仍在消費者可接受范圍內，獅子頭具有其特有的香氣，色澤均勻有光澤，但各組微生物含量已分別超過或將要超過調理肉制品的微生物限量標準。貯藏21 d時，各組獅子頭感官上才出現明顯差異，對照組、MAP組及MAP-3 min組的氣味評分下降至3分及3分以下，其中對照組氣味劣變最明顯。貯藏21 d的MAP-9 min組整體接受度為4分，達到可接受范圍的最低值，其余組的獅子頭評分均在4分以下，已不被消費者接受。4℃冷藏過程中MAP-6 min和MAP-9 min兩組微生物數量、理化指標無顯著差異，感官品質無明顯不同，結合微生物數量、微生物生長動力學曲線及感官評價結果，認為MAP-6 min或MAP-9 min處理可將獅子頭貨架期延長7 d。

圖2 不同低溫等離子體處理時間對獅子頭貯藏過程中TVB-N含量的影響Fig.2 Effect of different cold plasma treated time on TVB-N content of meatballs during storage

圖3 不同低溫等離子體處理時間對獅子頭貯藏過程中TBARS值的影響Fig.3 Effect of different cold plasma treated time on TBARS value of meatballs during storage

2.5 低溫等離子體處理對獅子頭貯藏過程中揮發性有機化合物的影響

由感官評價結果可以發現，本試驗處理的獅子頭在貯藏至第21天時，感官變化最大，其中氣味指標變化較明顯。試驗對貯藏第0和第21天的各組獅子頭進行GC-IMS分析，進一步探究其揮發性化合物的組成變化。由表2可知，貯藏第0天的獅子頭共定性出25種化合物，其中醇類9種，酮類6種，醛類4種，酯類3種，其他類物質3種。醇類(1-丙醇、苯乙醇等)，酮類(2-己酮、2-庚酮等)，醛類(己醛、戊醛等)及酯類(乙酸乙酯、丙烯酸乙酯等)是貯藏第0天獅子頭的主要揮發性有機化合物，其中經低溫等離子體處理后獅子頭中的庚醇、1-己醇、1-丙醇、2-癸酮和壬醛的物質含量顯著高于對照組。主成分分析(圖5)結果發現，MAP、MAP-3 min和MAP-9 min組間差異較小，而MAP-6 min和其他組之間具有明顯差異，但在感官上并無明顯區別，可能與新鮮獅子頭中強烈的香辛料氣味有關。隨著貯藏時間的延長，獅子頭中1-己醇、正己醛、檸檬烯及2-甲基吡嗪的相對含量逐漸增加。貯藏第21天的樣品共定性出26種化合物，其中正丁醛、苯甲醛、2-丁酮、檸檬烯及2-甲基吡嗪的物質含量高于貯藏第0天，對照組腐敗獅子頭中2-己酮、2-丁酮、苯乙烯、2-甲基吡嗪及八甲基三硅氧烷的含量顯著高于其他處理組。根據圖5發現，貯藏第21天對照組獅子頭揮發性化合物與其他處理組相比具有明顯差異，MAP-6 min與MAP-9 min兩組之間主成分差異較小，MAP-3 min與MAP組之間的揮發性有機化合物主成分差異不明顯，這與感官分析的結果一致。將貯藏0和21 d不同處理的獅子頭樣品中已定性出的物質指標構成矩陣，利用SPSS軟件進行主成分分析，結果如表3所示。貯藏第0天確定主成分個數為5個，方差貢獻率分別為39.71%、30.39%、8.85%、7.59%、6.38%，累計貢獻率達到92.93%。貯藏第21天確定主成分個數為6個，方差貢獻率分別為45.34%、18.53%、13.86%、8.21%、4.58%、3.22%，累積方差貢獻率達到93.74%。經LAV軟件中Dynamic主成分分析處理得到的第0與第21天的PC1與PC2累計貢獻率均與SPSS軟件分析結果相似，表明結果有效。

圖4 不同低溫等離子體處理時間對獅子頭貯藏過程中感官品質的影響Fig.4 Effect of different cold plasma treated time on sensory quality of meatballs during storage

表2 不同低溫等離子體處理時間對獅子頭貯藏過程中揮發性有機化合物的影響Table 2 Effect of different cold plasma treated time on volatile organic compounds of meatballs during storage/(a.v.)

表2(續)

注：A：第0天主成分分析圖；B：第21天主成分分析圖。Note: A: The 0 d principal component analysis diagram. B: The 21 d principal component analysis diagram.圖5 不同貯藏時間下獅子頭揮發性有機化合物主成分分析圖Fig.5 Principal component analysis of volatile organic compounds of meatballs at different storage times

3 討論

低溫等離子體激發過程中會產生大量的活性氧(ROS)和活性氮(RNS)等活性成分(reactive species, RS)[31]。ROS和RNS能夠改變和降解細菌DNA等細胞成分，引起結構和功能異常，從而導致細菌死亡[32]。本研究發現，貯藏初期，經低溫等離子體處理后的獅子頭菌落總數可減少0.70～1.56 log CFU·g-1，顯著低于未經低溫等離子體處理組。王晨等[33]在低溫等離子體75 kV條件下處理鹽水鴨2 min后發現鹽水鴨菌落總數減少1.67 log CFU·g-1，菌落總數殺菌率高達97.8%，這與本研究結果相一致。隨著低溫等離子體處理時間的延長，獅子頭的殺菌效果更顯著，這主要與等離子體產生的活性物質含量有關[34]。

隨著貯藏時間的延長，大量微生物進行代謝活動，分解蛋白質，生成較多含氮物質。本研究發現氣調包裝協同低溫等離子處理可以顯著減緩獅子頭中TVB-N含量的增加，MAP組的TVB-N含量始終高于低溫等離子體處理組，但在貯藏過程中兩種處理之間無顯著差異，這表明氣調包裝對抑制產品中細菌及內源酶活性也有一定積極作用[35-36]。與本研究結果相似的是，喬維維[37]在低溫等離子體對牛肉品質的影響研究中發現經氣調包裝和低溫等離子體處理后的牛肉TVB-N含量增加速度顯著低于未處理組，在貯藏前7 d，與單獨氣調包裝相比，氣調包裝協同低溫等離子體處理對延緩牛肉TVB-N值增加更顯著。這可能與低溫等離子體處理抑制產品中微生物活動，延緩氨及胺類等含氮化合物產生有關[38]，當與氣調包裝共同作用于獅子頭保鮮時，抑制蛋白質分解的效果可能更加明顯。

表3 主成分的特征值和貢獻率Table 3 Eigenvalues and cumulative contribution rates of principal component

獅子頭在經低溫等離子體處理后，初始TBARS值增加，可能是因為等離子體電離氣體后產生含自由基等活性物質會從脂質分子中奪走氫離子，進而引發或加速脂質氧化[39]。徐慧倩等[38]探究了低溫等離子體對南美白對蝦冷藏期間品質的影響，發現低溫等離子體處理加速了對蝦的脂質氧化，可能是由于等離子體系中產生的ROS(如單線態氧、羥基自由基)奪走脂質分子中的氫離子，促進了脂質氧化相關的自由基鏈式反應[40]。李欣欣等[39]通過低溫等離子體處理醬牛肉后發現初期經低溫等離子體處理后的醬牛肉TBARS值略高于未處理組，但貯藏后期未處理組TBARS值顯著高于處理組，與本研究結果一致，這可能與等離子體中ROS壽命短[41]或低溫等離子體作用于肉制品后產生亞硝酸鹽，抑制脂質氧化[42]有關。

感官評價是衡量食品新鮮度的重要指標之一，其中食品氣味變化在感官上最明顯。肉制品中大多揮發性化合物，如醇、醛、酮及酯等物質，是由不飽和脂肪酸的化學氧化以及通過斯特勒克(Strecker)降解與蛋白質、肽和游離氨基酸的進一步相互作用產生的[43]。獅子頭經低溫等離子體處理后庚醇、1-己醇、1-丙醇、2-癸酮和己醛含量顯著高于未處理組，這可能與獅子頭中的脂肪氧化降解和不飽和脂肪酸的降解有關[44-45]。Chen等[46]研究發現火腿與空氣接觸后，火腿表面揮發性物質中的1-己醇含量顯著高于未與空氣接觸的火腿。大多數醇類物質是脂質氧化分解的產物，1-己醇與棕櫚酸和油酸氧化有關，1-丙醇可以由肉豆蔻酸氧化產生[47]。壬醛和己醛均是獅子頭中重要的揮發性物質[48]，這兩類醛類物質的閾值較低，具有清香氣味。酯類物質可以通過脂肪酸和醇類物質的酶促酯化反應產生，但在獅子頭中鑒定出的酯類物質種類較少。朱文政等[48]在研究不同烹制時間下獅子頭的揮發性物質時鑒定出的酯類物質種類少且含量低，對獅子頭的揮發性氣味影響不顯著。由于食品本身內源酶作用或微生物生長， 產品的揮發性化合物含量時刻會發生變化，當揮發性化合物的濃度超過可接受的閾值時，會使產品在感官上不被消費者所接受[49]。本研究中對照組腐敗獅子頭中的2-己酮、2-丁酮、苯乙烯、2-甲基吡嗪及八甲基三硅氧烷顯著高于其他處理組，可能與脂肪和蛋白質氧化降解程度高有關，其中產生的吡嗪物質主要來源于氨基酸和還原酮的Strecker降解[50]。較短時間的低溫等離子體處理對獅子頭揮發性化合物影響較小，85 kV低溫等離子體處理6 min或9 min條件下可以有效抑制獅子頭中腐敗氣味的產生，這可能與低溫等離子體對獅子頭的殺菌作用有關。

4 結論

本研究結果表明，氣調包裝協同低溫等離子體殺菌處理可以顯著降低獅子頭的初始微生物數量，延長產品貨架期。低溫等離子體處理對獅子頭脂質氧化有促進作用，但低溫等離子體處理的時間越長，對獅子頭的殺菌效果越明顯，可有效保持獅子頭新鮮度及感官品質。低溫等離子體處理會使獅子頭中的庚醇、1-己醇、1-丙醇、2-癸酮及壬醛物質等揮發性有機化合物增加，2-己酮、2-丁酮、苯乙烯、2-甲基吡嗪及八甲基三硅氧烷等揮發性有機物可能是組成獅子頭腐敗氣味的主要成分。綜合各項品質指標及經濟成本發現，40%CO2+60%N2氣調包裝協同低溫等離子體處理6 min可以在顯著抑制微生物生長的同時保持獅子頭品質，產品貨架期可達到14 d。