阿司匹林和氯吡格雷聯合應用對小鼠腦缺血恢復期RAGE及sRAGE表達的影響

溫少紅，劉向榮，趙順英，董雯，陳青芳，陳文濤，李子孝，2，王春娟，2

卒中是我國居民的第三位死亡原因，其中缺血性卒中占80%，是獲得性長期殘疾的第一大原因[1]。研究證實阿司匹林和氯吡格雷聯合治療21 d可降低輕型缺血性卒中或TIA患者的卒中復發率和致殘率[2-3]。但目前缺少阿司匹林和氯吡格雷聯合治療有效性的機制研究。

晚期糖基化終末產物受體（receptor for advanced glycation end products，RAGE）是免疫球蛋白超家族成員之一，廣泛存在于神經元、膠質細胞和內皮細胞中[4-5]，可以作為細胞壞死性死亡的傳感器，促進炎癥發生并加劇缺血性腦損傷[6-7]；另一方面，可溶性RAGE（soluble RAGE，sRAGE）作為誘餌受體，可以與細胞表面的RAGE競爭配體，從而阻斷RAGE介導的炎癥相關跨膜信號轉導[8]。腦缺血引起的炎癥級聯反應會導致神經組織損傷和細胞死亡，同時也在組織重塑和修復中發揮重要作用[9]。因此，推測RAGE和sRAGE在缺血性卒中的病理生理機制中可能發揮重要作用。本研究旨在探索阿司匹林和氯吡格雷聯合應用對小鼠大腦中動脈遠端缺血再灌注模型恢復期RAGE及sRAGE表達的影響及其可能機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 選取8～10周C57BL/6雄性小鼠60只，購于北京華阜康生物科技控股有限公司。本實驗遵照北京市神經外科研究所實驗動物福利倫理委員會要求進行（動物倫理批號：202002003），實驗小鼠采用標準飼料和純凈水分籠飼養，飼養溫度22～24 ℃，相對濕度50%～60%，12 h循環照明。

1.2 模型制作 小鼠稱體重后，隨機分為假手術組、溶劑組、阿司匹林和氯吡格雷聯合組（雙抗組），每組各20只。小鼠大腦中動脈遠端缺血再灌注模型（distal middle cerebral artery occlusion-reperfusion，dMCAO-R）制作方法如下：異氟醚麻醉小鼠，在小鼠右眼和右耳之間進行皮膚切口，在顱骨上鉆孔，使用30G鈍頭針壓迫暴露的大腦中動脈遠端；血管閉塞60 min后取針實現腦血流部分再灌注[10]。假手術組在顱骨上鉆孔后只分離血管，不壓迫大腦中動脈遠端。術中通過激光多普勒血流儀（瑞沃德，中國）監測腦血流判斷模型是否成功，體溫維持儀維持小鼠術中肛溫37±0.5 ℃。

1.3 實驗用藥的溶液配制與給藥 本研究所用阿司匹林為拜耳醫藥保健有限公司生產的阿司匹林腸溶片（每片100 mg，批號BJ49807）；氯吡格雷為賽諾菲（杭州）制藥有限公司生產的硫酸氫氯吡格雷片（每片75 mg，批號9A866）。阿司匹林和氯吡格雷混合液配制方法：①取阿司匹林腸溶片用研缽磨碎，將藥粉轉移至離心管內，加入8.333 mL飲用水，吹打均勻并標記；②取硫酸氫氯吡格雷片用研缽磨碎，將藥粉轉移至另一離心管內，加入6.250 mL飲用水，吹打均勻并標記；③分別取6.250 mL阿司匹林混合液、6.250 mL氯吡格雷混合液、12.500 mL飲用水混合，此混懸液中阿司匹林和氯吡格雷的濃度均為3 mg/mL。模型前小鼠體質量為25 g，阿司匹林和氯吡格雷給藥劑量均為12 mg/kg，因此每只小鼠每次需混懸液體積100 μL。雙抗組再灌注后即刻灌胃給予阿司匹林和氯吡格雷混懸液100 μL，后每日同劑量灌胃1次，連續21 d；溶劑組給予同等體積飲用水灌胃，持續21 d；假手術組不給藥。實驗流程見圖1。

圖1 實驗流程圖

1.4 神經功能評價 腦缺血后1、3、5、7、9、11、14、21 d分別進行改良加西亞神經功能評分，該評分包括本體感覺、胡須碰觸、肢體對稱性、側轉向和前肢行走5項，每項滿分3分，總分15分[11]。1.5 取材 21 d神經功能評價結束后，進行小鼠眼球內眥采血和腦組織取材。

眼球內眥采血：麻醉小鼠后，用左手手指壓迫小鼠頸部兩側，使眼球充分外突，右手持毛細采血管沿內眥插入內眼角，輕輕向眼底方向刺入，收集血液。3000 rpm離心10 min留取血清置于-80℃冰箱備用，后續用于酶聯免疫吸附劑測定（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）檢測血清中sRAGE表達水平（每組6只）。

腦組織：①麻醉小鼠后，使用手術器械依次剪開頭皮、顱骨，取出小鼠大腦，分離缺血側皮層組織置于-150 ℃冰箱備用。部分用于免疫印記實驗檢測RAGE相對表達水平（每組5只）；部分用于實時熒光定量PCR檢測炎癥因子及RAGE的mRNA表達水平（每組5只）。②麻醉小鼠后，依次采用磷酸鹽緩沖液、固定液對小鼠進行心臟灌流，灌流結束后取大腦依次浸泡于固定液、30%蔗糖溶液中，后續進行冰凍切片及免疫熒光染色（每組4只）。

1.6 酶聯免疫吸附試驗 取血清樣本，采用小鼠晚期糖基化終末產物特異性受體ELISA試劑盒（CSB-EL001441MO，武漢華美生物）檢測血清sRAGE表達水平。具體方法如下：向酶標板中依次加入樣本或標準品、生物素化的抗RAGE抗體、辣根過氧化物酶標記的親和素，洗滌后用底物顯色。底物在過氧化物酶的催化下轉化成藍色，并在酸的作用下轉化成最終的黃色。用酶標儀（TECAN，瑞士）在450 nm波長下測定吸光度（optical density，OD），計算樣本中sRAGE濃度。

1.7 免疫印跡試驗 取小鼠缺血側皮層組織樣本，研磨后12 000 rpm離心20 min，取上清液經BCA蛋白檢測試劑盒（Pierce，美國）定量后依次進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳、蛋白轉膜、膜的封閉、一抗（Proteintech，美國，稀釋比例1∶800）孵育、二抗（抗鼠IgG，CST，美國，稀釋比例1∶2500）孵育、發光液顯影，通過G：BOX化學發光成像系統（Syngene，英國）檢測蛋白條帶，使用Image J軟件分析圖像并計算RAGE的相對表達量。內參抗體為甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）（景杰生物，中國，稀釋比例1∶1000）。

1.8 熒光實時定量PCR 應用RNA提取試劑盒（Qiagen，德國）提取小鼠缺血側皮層組織RNA，應用逆轉錄試劑盒（Takara，日本）將mRNA逆轉錄成cDNA，之后進行實時熒光定量PCR擴增。應用2-ΔΔCt計算溶劑組、雙抗組與假手術組之間擴增指標的相對表達量。擴增指標包括CD16、CD32、CD11b、誘導型一氧化氮合成酶（inducible nitric-oxide synthase，iNOS）、CD206、精氨酸酶1（arginase1，Arg1）、轉化生長因子β（transforming growth factor β，TGF-β）、幾丁質酶樣蛋白（chitinase-like 3，Chil3/Ym1/2）、RAGE。引物購自英維捷基（上海）貿易有限公司，其序列見表1[12]，其中RAGE引物序列采用Primer Premier 6.0軟件設計。

表1 引物序列

1.9 免疫組織熒光染色 取小鼠腦組織樣本進行冰凍切片。切片依次進行破膜、封閉、一抗孵育、二抗孵育、4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（4'，6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride，DAPI）封片。其中一抗RAGE（Proteintech，美國，稀釋比例1∶200）分別與神經元特異核蛋白（neuronal nuclei，NeuN）（Merck，美國，稀釋比例1∶500）、膠質纖維酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP）（CST，美國，稀釋比例1∶500）免疫熒光共染，標記神經元和星形膠質細胞，DAPI標記細胞核。使用激光共聚焦顯微鏡（Carl Zeiss AG，德國）觀察RAGE與梗死周邊區神經元、星形膠質細胞共定位情況并拍照，使用Image J軟件對RAGE+NeuN+細胞計數。1.10 統計學方法 采用GraphPad Prism 8.0.2軟件進行統計分析，計量資料符合正態分布，以表示；多時間點多組比較采用雙因素方差分析，在整體差異有統計學意義的情況下進行Bonferroni法兩兩比較；單時間點多組比較采用單因素方差分析，在整體差異有統計學意義的情況下進行Tukey檢驗兩兩比較。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 神經功能評分結果 缺血再灌注后1、3、5、7、9、11、14、21 d評價小鼠改良加西亞評分，結果顯示3組間本體感覺、胡須碰觸和總分差異均有統計學意義。兩兩比較顯示，溶劑組各時間點各分項評分及總評分均低于假手術組，差異有統計學意義；雙抗組各時間點各分項評分及總評分均低于假手術組，差異有統計學意義；雙抗組3 d時胡須碰觸評分（P=0.0067）、3 d時總評分（P=0.0140）、9 d時總評分（P=0.0406）高于溶劑組，差異有統計學意義（表2）。

表2 缺血再灌注后小鼠不同時間改良加西亞評分結果[單位：分]

2.2 血清sRAGE及缺血側皮層RAGE表達水平缺血再灌注21 d時，3組間血清sRAGE水平差異有統計學意義，兩兩比較顯示，雙抗組血清sRAGE水平高于溶劑組（P=0.0120）；3組間缺血側皮層RAGE相對表達量差異無統計學意義（表3，圖2）。

圖2 缺血再灌注21 d小鼠血清sRAGE濃度及缺血側皮層RAGE相對表達量

表3 缺血再灌注21 d小鼠血清sRAGE濃度及缺血側皮層RAGE相對表達量

2.3 缺血側皮層炎癥因子及RAGE的mRNA相對表達情況 缺血再灌注21 d，3組間除Arg1外，缺血側皮層其他炎癥因子和RAGE的mRNA相對表達量差異均有統計學意義（表4）。兩兩比較顯示，與假手術組相比，溶劑組各炎癥因子和RAGE的mRNA水平均升高，差異有統計學意義；與假手術組相比，雙抗組除CD32、iNOS外，其他其他炎癥因子和RAGE的mRNA水平均升高，差異有統計學意義；與溶劑組相比，雙抗組iNOS（P=0.0164）、RAGE（P=0.0071）的mRNA表達水平降低，差異有統計學意義（表4）。

表4 缺血再灌注21 d小鼠缺血側皮層炎癥因子及RAGE的mRNA相對表達量

2.4 缺血小鼠腦梗死周邊區RAGE和神經元、星形膠質細胞共定位情況 缺血再灌注21 d，采用Image J軟件統計RAGE+/NeuN+細胞在單位面積（1 mm2）的數量，假手術組為421.391±122.56個，溶劑組為814.437±165.758個，雙抗組為328.798±35.183個，3組間差異有統計學意義（F=18.24，P=0.0007）；兩兩比較顯示，假手術組、雙抗組與溶劑組的差異均有統計學意義（P=0.0088、0.0012）（圖3）。

3 討論

目前，阿司匹林和氯吡格雷聯合治療已廣泛應用于臨床預防輕型缺血性卒中和TIA的復發，因其可以改善卒中患者發病90 d的功能預后，降低卒中復發的整體致殘率[3-4]。根據臨床研究結果以及本課題組前期的基礎研究，阿司匹林和氯吡格雷聯合治療的最佳臨床獲益時間為卒中發生后的前3周內[2，10，13]，因此本研究選擇小鼠腦缺血再灌注后21 d作為各項指標的考察時間，旨在探索阿司匹林和氯吡格雷聯合治療可能的保護機制。本研究神經功能評價的結果顯示，阿司匹林和氯吡格雷聯合給藥可以在一定程度上提高腦缺血再灌注小鼠改良加西亞評分（3 d時胡須碰觸評分、3 d時總分、9 d時總分），提示其可以促進腦缺血再灌注小鼠短期神經功能的恢復。

RAGE是一種涉及多種慢性炎癥狀態的多配體模式識別受體，可以結合并介導一系列與損傷相關分子模式分子的細胞反應。細胞和動物模型實驗證實，阻斷RAGE信號可以減輕炎癥反應，減少糖尿病血管并發癥、心血管疾病以及腫瘤的進展[14]。本研究中，缺血再灌注21 d時，雙抗組小鼠血清sRAGE水平較溶劑組升高（P=0.0120），缺血側皮層中RAGE的mRNA相對表達量較溶劑組降低（P=0.0071），提示阿司匹林和氯吡格雷聯合治療除了抗血小板外，還可能通過上調sRAGE的表達水平，減輕腦缺血后的炎癥反應。

本研究還考察了小膠質細胞相關炎癥因子的相對表達量，其中雙抗組和溶劑組的CD16、CD32、CD11b、CD206、Arg1、TGF-β、Ym1/2表達水平差異無統計學意義。既往研究提示缺血性卒中后梗死周邊區小膠質細胞發生動態極化[12]：M2型小膠質細胞（抗炎表型）表達在7 d內短暫性升高而后逐漸下降，M1型小膠質細胞（促炎表型）表達在3 d時開始逐漸升高直至14 d出現下降。推測在本研究選取的考察時間，即卒中后21 d，小膠質細胞不同表型的表達已處于動態平衡，因此未能觀測到相關炎癥因子的變化。值得關注的是，雙抗組小鼠缺血側皮層中促炎因子iNOS的表達水平較溶劑組顯著下降（P=0.0164）。缺血誘導的iNOS+炎癥細胞除了直接釋放NO外，還通過產生各種炎癥因子觸發炎癥級聯反應，從而導致神經元損傷[15]。推測iNOS與RAGE在缺血性卒中的發生發展中產生了協同作用，另一方面iNOS表達水平下調也可能與sRAGE表達上調相關。sRAGE可在心血管疾病中抑制氧化應激和炎癥反應，被認為是心血管事件發生和復發的重要標志物[16]。已有報道提示sRAGE在急性缺血性卒中患者功能預后中具有保護性作用，發病48 h時其血漿表達水平是急性缺血性卒中患者預后顯著的預測指標[17]。

本研究在動物模型中對腦缺血后RAGE、sRAGE及相關炎癥因子表達水平的變化進行了分析，但測定的時間點為恢復期（21 d），不能明確上述指標在腦缺血急性期內的變化趨勢，并與小鼠缺血急性期內的神經功能變化相對應。后續研究將進一步深入探索腦缺血后上述炎癥指標的變化曲線及其可能的互相影響的機制。

【點睛】阿司匹林和氯吡格雷聯合應用可在小鼠腦缺血恢復期調控RAGE表達，減輕炎癥，發揮腦保護作用。