PI3K/AKT信號通路介導(dǎo)脂聯(lián)素對腦缺血再灌注大鼠的保護作用

何俊芳，劉新平，呂學(xué)海，王斌

腦缺血再灌注損傷的機制可能涉及炎癥、凋亡、氧化應(yīng)激和細胞自噬等[1]。脂聯(lián)素是脂肪細胞產(chǎn)生的一種可與細胞外基質(zhì)相互作用的細胞因子，具有抗動脈粥樣硬化、抗炎和抗氧化應(yīng)激等作用[2]。有研究發(fā)現(xiàn)，高血壓和腦梗死患者體內(nèi)血漿脂聯(lián)素水平顯著低于正常人群，認為脂聯(lián)素對腦缺血再灌注具有保護作用[3]。磷脂酰肌醇3激酶（phosphatidylinositol-3-kinase，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，PKB）信號通路是細胞內(nèi)關(guān)鍵的信號傳導(dǎo)途徑之一。動物實驗發(fā)現(xiàn)，脂聯(lián)素預(yù)處理可激活PI3K/PKB信號通路，改善大鼠心肌缺血，使用PI3K抑制劑LY294002干預(yù)處理可抑制脂聯(lián)素對大鼠心肌缺血的改善作用[4]。

本研究通過建立大腦中動脈閉塞（middle cerebral artery occlusion，MCAO）缺血再灌注模型大鼠并給予脂聯(lián)素治療或PI3K抑制劑處理，旨在探究脂聯(lián)素對大鼠腦梗死的作用機制，以期為腦梗死防治提供基礎(chǔ)實驗依據(jù)。

1 對象與方法

1.1 實驗動物建模與分組 雄性健康SD大鼠，體質(zhì)量250～280 g，適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d。造模手術(shù)前禁食12 h，腹腔注射10%水合氯醛（300 mg/kg）麻醉大鼠，采用右側(cè)頸內(nèi)動脈（internal carotid artery，ICA）線栓法結(jié)扎方法制備MCAO缺血再灌注模型。頸前正中切口后逐層分離，暴露出右頸總動脈、頸外動脈和右側(cè)ICA，然后將18 mm單股3～0號尼龍線插入右側(cè)ICA并結(jié)扎，缺血1.5 h后移除尼龍線實現(xiàn)再灌注。將血流儀的探針固定于大鼠顱骨平面，當檢測顯示大鼠的腦血流量恢復(fù)至基線水平表示缺血再灌注成功，則可以縫合切口。待大鼠自然蘇醒后，根據(jù)Longa 5分法評估MACO缺血再灌注造模大鼠成功與否[5]。0分：正常；1分：無法伸展對側(cè)前爪；2分：向外側(cè)轉(zhuǎn)圈；3分：向?qū)?cè)傾倒；4分：無法自發(fā)行走，意識喪失。1～3分表示建模成功，剔除0和4分的大鼠。

本研究將大鼠分為①假手術(shù)組：大鼠接受皮膚切口處理，但是不進行尼龍線插入ICA和結(jié)扎，其余操作相同，然后給予大鼠尾靜脈注射0.9%生理鹽水（0.09 mL/100 g）；②模型組：大鼠缺血再灌注2 h后，給予尾靜脈注射0.9%生理鹽水（0.09 mL/100 g）；③脂聯(lián)素治療組：采用0.9%生理鹽水溶液將脂聯(lián)素（美國Phoenix公司，批號426002）稀釋至2 mg/mL，大鼠缺血再灌注2 h后，按照大鼠體質(zhì)量一次性給予尾靜脈注射脂聯(lián)素（180 μg/100 g）；④PI3K/PKB抑制劑（LY294002，美國Sigma公司，HY-10108）組：大鼠缺血再灌注2 h后，按照大鼠體質(zhì)量一次性給予尾靜脈注射脂聯(lián)素（180 μg/100 g）+LY294004（0.03 mg/100 g）。以上每組15只大鼠。

大鼠腦缺血再灌注24 h后根據(jù)Longa 5分法再次進行腦神經(jīng)功能評分。檢測完神經(jīng)功能評分后麻醉大鼠，快速斷頭取腦，-20 ℃冷凍處理30 min，剝離腦殼后分離腦組織。每組取5只用于腦梗死面積測定，5只用于腦含水量測定，剩余5只大鼠的腦組織與生理鹽水混合破碎制成組織混液，用于PI3K、PKB、磷酸化的蛋白激酶B（phosphorylated PKB，p-PKB）和脂聯(lián)素蛋白表達水平的測定和炎癥因子血清丙二醛（malondialdehyde，MDA）和超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）水平的測定。

1.2 腦梗死面積和腦含水量測定 將大鼠的腦組織從額極向后做連續(xù)冠狀切片（5片），再將腦片置入2，3，5-氯化三苯基四氮唑（triphenyl tetrazolium chloride，TTC）中溫浴30 min。染色結(jié)果白色為梗死灶，紅色為正常腦組織。染色后，將腦切片在4%多聚甲醛中固定，采用Image J軟件計算梗死面積，計算公式為：（缺血區(qū)面積/腦片面積）×100%。腦組織含水量檢測：每組取5只大鼠的腦組織，去掉嗅球、小腦和低位腦干，稱量為大腦濕質(zhì)量，烘烤72 h后稱量為干質(zhì)量。腦含水量（%）=[（濕質(zhì)量-干質(zhì)量）／濕質(zhì)量]×100%。

1.3 PI3K、PKB、p-PKB和脂聯(lián)素蛋白表達水平測定 各組分別各取5只大鼠腦組織混液各2 mL，加入1 μL裂解液，將組織混液離心處理（4 ℃，12 000 r/min，20 min），取上清液通過聚氰基丙烯酸正丁酯（butyleyanoacrylate，BCA）蛋白質(zhì)測定試劑盒（碧云天生物技術(shù)研究所）定量樣品濃度。采用12.5%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，隨后再電泳轉(zhuǎn)移至聚乙烯基氟化物膜，經(jīng)過5%的牛血清蛋白室溫封閉1 h，然后與兔單克隆抗體PI3K（1∶1000）、兔多克隆抗體PKB（1∶1000）、兔多克隆抗體p-PKB（1∶1000）、兔單克隆抗體脂聯(lián)素（1∶1000）和兔單克隆抗體甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）（1∶1000）一抗在4 ℃下孵育過夜處理。將膜用洗滌緩沖液洗滌5次/分，然后與辣根過氧化物酶標記的兔抗IgG二抗（1∶2000）在室溫下孵育1 h，然后成像并使用Image J軟件對蛋白質(zhì)條帶進行分析，以灰度值表示。GAPDH用作內(nèi)部對照，PKB作為p-PKB的比值對照。

1.4 腦組織炎癥因子MDA和SOD水平測定各組分別取5只大鼠的腦組織混液2 m L，3000 r/min離心10 min取上清液，采用SOD檢測試劑盒（南京建成生物技術(shù)研究所）和MDA檢測試劑盒（南京建成生物技術(shù)研究所）分別檢測SOD和MDA水平。取10 μL上清樣品和40 μL稀釋液于微孔酶標板中，每孔分別加入100 μL辣根過氧化物酶標記的檢測抗體，封孔后37 ℃水浴溫育60 min，去液后洗滌5次。然后每孔加入50 μL底物貯備液稀釋液（1∶200稀釋），37 ℃避光孵育15 min。最后每孔加入50 μL終止液，MDA測定450 nm波長的OD值，SOD測定550 nm波長OD值。

1.5 統(tǒng)計方法 采用SPSS 18.0軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，正態(tài)分布的計量資料用表示，多組間分析比較采用單因素方差檢驗，兩組內(nèi)再采用最小顯著差異檢驗（LSD-t）。非正態(tài)分布數(shù)據(jù)采用M（P25～P75）進行統(tǒng)計描述，采用非參數(shù)檢驗進行組間比較。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 脂聯(lián)素對腦缺血再灌注大鼠腦梗死面積、腦含水量和神經(jīng)功能的影響 各組大鼠腦梗死面積、腦含水量和神經(jīng)功能缺損評分的整體差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.001）。與假手術(shù)組相比，模型組、脂聯(lián)素治療組、抑制劑組的腦梗死面積、腦含水量和神經(jīng)功能缺損評分均升高（均P＜0.001）；與模型組比較，脂聯(lián)素治療組大鼠的腦梗死面積、腦含水量和神經(jīng)功能缺損評分均降低（均P＜0.001），抑制劑組大鼠的腦梗死面積（P=0.292）、腦含水量（P=0.145）和神經(jīng)功能缺損評分（P=0.406）差異無統(tǒng)計學(xué)意義；與脂聯(lián)素治療組比較，抑制劑組大鼠的腦梗死面積、腦含水量和神經(jīng)功能缺損評分均升高（均P＜0.001）（表1）。

表1 脂聯(lián)素對腦缺血再灌注大鼠腦梗死面積、腦含水量、神經(jīng)功能缺損的影響

2.2 脂聯(lián)素對腦缺血再灌注大鼠腦組織脂聯(lián)素蛋白表達水平的影響 假手術(shù)組、模型組、脂聯(lián)素治療組和抑制劑組大鼠腦組織脂聯(lián)素蛋白表達水平分別為0.95±0.03、0.73±0.07、0.92±0.04和0.81±0.03，組間整體差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=23.69，P＜0.001）。與假手術(shù)組相比，模型組和抑制劑組的腦組織脂聯(lián)素蛋白水平降低（均P＜0.001），脂聯(lián)素治療組的腦組織脂聯(lián)素蛋白水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.318）；與模型組比較，脂聯(lián)素治療組的腦組織脂聯(lián)素蛋白水平升高（P＜0.001）；與脂聯(lián)素治療組比較，抑制劑組的腦組織脂聯(lián)素蛋白水平降低（P=0.002）（圖1）。

圖1 脂聯(lián)素對腦缺血再灌注大鼠腦組織脂聯(lián)素蛋白表達水平的影響

2.3 脂聯(lián)素對腦缺血再灌注大鼠腦組織PI3K/PKB信號通路的影響 各組大鼠腦組織中PI3K（F=25.58，P＜0.001）和p-PKB蛋白（F=17.68，P＜0.001）相對表達水平整體差異有統(tǒng)計學(xué)意義。與假手術(shù)組相比，模型組大鼠的腦組織PI3K（0.73±0.05vs. 0.93±0.03，P＜0.001）和p-PKB（0.82±0.05vs. 0.97±0.04，P＜0.001）蛋白表達水平均降低，抑制劑組大鼠的腦組織PI3K（0.75±0.04vs. 0.93±0.03，P＜0.001）和p-PKB（0.81±0.04vs. 0.97±0.04，P＜0.0 01）蛋白表達水平也均降低；與模型組比較，脂聯(lián)素治療組大鼠的腦組織PI3K（0.89±0.05vs. 0.73±0.05，P＜0.001）和p-PKB（0.94±0.03vs. 0.82±0.05，P＜0.0 01）蛋白表達水平均升高；與脂聯(lián)素治療組比較，抑制劑大鼠的腦組織PI3K（0.75±0.04vs. 0.89±0.05，P＜0.001）和p-PKB（0.81±0.04vs. 0.94±0.03，P＜0.001）蛋白表達水平均降低（圖2）。

圖2 脂聯(lián)素對腦缺血再灌注大鼠腦組織PI3K/PKB信號通路的影響

2.4 脂聯(lián)素對腦缺血再灌注大鼠氧化應(yīng)激的影響 各組大鼠腦組織中SOD和MDA水平整體差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.001）。與假手術(shù)組比較，模型組、脂聯(lián)素治療組和抑制劑組的腦組織中SOD水平降低（均P＜0.001），MDA水平升高（均P＜0.001）；與模型組比較，脂聯(lián)素治療組大鼠的腦組織中SOD水平升高（P＜0.001），MDA水平降低（P＜0.001），抑制劑組大鼠的腦組織中SOD（P=0.065）和MDA（P=0.161）水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義；與脂聯(lián)素治療組比較，抑制劑組大鼠的腦組織中SOD水平降低（P＜0.001），MDA水平升高（P＜0.001）。具體數(shù)據(jù)見表2。

表2 脂聯(lián)素對腦缺血再灌注大鼠腦氧化應(yīng)激的影響

3 討論

腦缺血過程中氧化應(yīng)激反應(yīng)加劇，可能導(dǎo)致自由基氧化產(chǎn)物（如MDA）水平的升高，以及抗氧化產(chǎn)物（SOD等）水平的降低[6]。過量自由基的產(chǎn)生會導(dǎo)致機體微環(huán)境內(nèi)自由基和抗氧化物的動態(tài)平衡被破壞，進而會加劇炎癥反應(yīng)和呼吸鏈等一系列生理反應(yīng)的破壞。

本研究中MCAO大鼠的腦組織壞死，腦水腫明顯，同時出現(xiàn)明顯的神經(jīng)功能缺損。在反映氧化應(yīng)激的指標上，MCAO大鼠腦組織內(nèi)自由基氧化產(chǎn)物MDA水平升高，而對應(yīng)的抗氧化產(chǎn)物SOD水平降低。當MCAO大鼠接受脂聯(lián)素治療后，其腦組織損傷和氧化應(yīng)激反應(yīng)的各項指標均得到顯著改善，接近于假手術(shù)組大鼠的生理水平，說明脂聯(lián)素對腦缺血再灌注損傷可能存在一定的治療和改善作用。有研究也顯示脂聯(lián)素對急性腦缺血再灌注大鼠具有一定的神經(jīng)保護作用，與本研究結(jié)果類似[7]。

脂聯(lián)素是一種對機體有保護作用的脂肪因子。近期有研究發(fā)現(xiàn)，脂聯(lián)素與肥胖、高血壓、糖尿病和心腦血管等疾病密切相關(guān)，可減輕動脈粥樣硬化病變，在抗炎、抗糖尿病和抗動脈粥樣方面均顯示出了良好的潛力[8]。有研究顯示，腦梗死后脂聯(lián)素水平降低，且與不穩(wěn)定動脈粥樣硬化斑塊形成有關(guān)[9]。還有研究顯示，脂聯(lián)素基因敲除的MCAO大鼠表現(xiàn)出腦梗死面積和心肌細胞凋亡增加，而當大鼠體內(nèi)過表達脂聯(lián)素時，其腦缺血再灌注損傷相應(yīng)降低[10]。白浩等[11]的研究顯示，經(jīng)脂聯(lián)素處理后，腦缺血再灌注小鼠的腦梗死面積減少、神經(jīng)功能改善，同時其腦水腫程度和細胞凋亡情況也均得到改善。本研究中，經(jīng)脂聯(lián)素治療處理的腦缺血再灌注大鼠的腦梗死面積、腦水腫、神經(jīng)功能缺損均顯著降低，而脂聯(lián)素水平升高。這進一步證實了脂聯(lián)素在腦缺血再灌注中的抗損傷作用。

PI3K/PKB通路是維持細胞生存的重要信號通路系統(tǒng)。PI3K/PKB可通過減輕細胞凋亡、氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)進而改善腦缺血再灌注損傷。有研究發(fā)現(xiàn)，PI3K/PKB信號通路對缺血動物模型有保護作用[8]。還有研究顯示脂聯(lián)素可通過激活PI3K/PKB信號通路改善心肌缺血大鼠的心肌損傷[9-10]。p-PKB是PKB磷酸化的形式，在PI3K/PKB途徑中，p-PKB是一種活化蛋白形式，也是發(fā)揮蛋白作用的形式，p-PKB/PKB通路激活的程度主要體現(xiàn)于PKB蛋白中被活化后p-PKB蛋白的含量。本研究中，經(jīng)過脂聯(lián)素治療的腦缺血再灌注大鼠，其腦組織中PI3K和p-PKB蛋白表達水平均升高，提示PI3K/PKB信號通路被激活。對應(yīng)的，脂聯(lián)素治療組大鼠腦損傷減輕，神經(jīng)功能改善，同時抗氧化產(chǎn)物SOD水平升高，反映體內(nèi)氧化應(yīng)激反應(yīng)改善，提示脂聯(lián)素與PI3K/PKB信號通路在改善大鼠缺血再灌注損傷過程中存在相互關(guān)系。本研究抑制劑組采用PI3K/PKB信號通路抑制劑LY294002處理，可以逆轉(zhuǎn)脂聯(lián)素對腦缺血再灌注大鼠腦組織損傷和神經(jīng)功能改善的作用。這也間接證明PI3K/PKB信號通路在改善腦缺血再灌注大鼠腦損傷中的積極作用。

綜上所述，本研究通過構(gòu)建MCAO腦缺血再灌注大鼠模型，采用脂聯(lián)素治療處理，顯著改善了大鼠的腦損傷情況，說明脂聯(lián)素對腦缺血再灌注有明顯保護作用，且該保護機制可能與激活PI3K/PKB信號通路從而抑制氧化應(yīng)激有關(guān)。但本研究存在一定的不足，如脂聯(lián)素治療大鼠后，對其細胞生理層面的變化沒有進行探索，這是后續(xù)研究需要關(guān)注的重點。

【點睛】本研究對MCAO腦缺血再灌注模型大鼠進行脂聯(lián)素治療和PI3K/PKB通路抑制劑LY294002干預(yù)，發(fā)現(xiàn)脂聯(lián)素可以減輕大鼠腦缺血再灌注損傷，其可能通過激活PI3K/PKB通路發(fā)揮神經(jīng)保護作用。