玉米ZmPRR1-1 基因啟動(dòng)子的克隆及序列分析

仝幀翰，劉青青，張嚴(yán)玲，王雷立，李安然，董柯清，王聞琦，王盼盼，王翠玲

(河南科技大學(xué)，河南 洛陽 471023)

生物鐘(Circadian clock)是植物中一種重要的計(jì)時(shí)機(jī)制，通過感受外部環(huán)境因子的晝夜周期變化并相應(yīng)地協(xié)調(diào)生物過程，從而在最有利的晝夜和季節(jié)時(shí)間來分配資源[1-3]。開花所需的特定光照時(shí)間被稱為光周期，生物鐘是光周期調(diào)節(jié)的關(guān)鍵組成部分。在光周期途徑中，光感受器感知光信號(hào)并將其傳遞給生物鐘，生物鐘產(chǎn)生生物節(jié)律并轉(zhuǎn)移到下游調(diào)節(jié)基因[4]。CO-like、CO、TOC1三類包含CCT(Co-like CO and TOC1)結(jié)構(gòu)域的基因，是光周期誘導(dǎo)的開花調(diào)控途徑中重要組成部分。CCT基因最早在擬南芥中鑒定，該基因存在43～45 個(gè)氨基酸組成的保守CCT 功能域。CCT 基因家族根據(jù)其基序組成的不同，可分為COL(Constans Like)、CMF(CCT Motif Family)和PRR(Pseudo-Response Regulator)3 個(gè)亞家族[5]。除了CCT 結(jié)構(gòu)域外，COL 蛋白還具有一個(gè)或兩個(gè)B-box[6]，CMF 蛋白僅包含CCT 結(jié)構(gòu)域，而PRR 蛋白除了羧端的CCT 結(jié)構(gòu)域外，在氨基端還包含REC 結(jié)構(gòu)域。CCT 基因家族不同成員在開花、脅迫等多種生命活動(dòng)及代謝調(diào)控網(wǎng)絡(luò)機(jī)制中發(fā)揮重要作用，具有多樣性的基因功能。作為CCT 基因家族的一個(gè)重要亞家族，PRR 基因家族成員參與調(diào)節(jié)晝夜節(jié)律、開花的光周期反應(yīng)，并且在控制非生物/生物脅迫反應(yīng)和其他生長(zhǎng)發(fā)育等途徑中發(fā)揮重要作用[7-9]。目前，除在擬南芥[10-11]和水稻中[12-13]PRR 基因研究較充分外，在少數(shù)重要作物如大麥[14]、玉米[15]、高粱[16]、小麥[17-19]等也有少量研究。PRRs在模式植物擬南芥中的研究已經(jīng)相當(dāng)清晰，其中TOC1(Timing of CAB1)基因作為植物晝夜節(jié)律系統(tǒng)的中心振蕩器，調(diào)節(jié)光周期開花反應(yīng)[10]。在植物中，光周期基因通過影響從營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)階段向生殖生長(zhǎng)階段過渡的時(shí)間，調(diào)控植物生長(zhǎng)[20]。PRR是高度保守的蛋白，目前在擬南芥和水稻中發(fā)現(xiàn)的PRR 家族都由5 個(gè)PRR 基因家族成員組成，所有成員都擁有N 端的REC 結(jié)構(gòu)域和C 端的CCT 結(jié)構(gòu)域。

生物鐘影響植物的開花調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，而PRR1基因作為PRR 家族成員在生物鐘的輸入和輸出途徑中扮演著重要角色。在對(duì)擬南芥的研究中發(fā)現(xiàn)，PRR1基因表達(dá)增加會(huì)促進(jìn)CCA1和LHY基因的表達(dá)，而PRR1過表達(dá)卻會(huì)導(dǎo)致CCA1和LHY的表達(dá)量降低[21]；OsPRR1會(huì)對(duì)冷脅迫的刺激做出反應(yīng)[22]；HvPRR1可以調(diào)節(jié)晝夜節(jié)律和調(diào)控開花[23]。玉米屬于短日照作物，對(duì)光敏感的臨界日照時(shí)數(shù)為12～13 h，隨著光照時(shí)間的延長(zhǎng)，玉米在生長(zhǎng)過程中表現(xiàn)出諸多不適[24]。目前對(duì)PRR基因的研究主要集中在擬南芥等植物中[25]，玉米中PRR基因的研究鮮有報(bào)道。本研究克隆獲得ZmPRR1-1的啟動(dòng)子序列，并進(jìn)行生物信息學(xué)分析，以期對(duì)ZmPRR1-1啟動(dòng)子的調(diào)控核心區(qū)域、潛在的順式元件等進(jìn)行詳細(xì)分析，為進(jìn)一步研究該基因的調(diào)控方式、基因功能及可能參與調(diào)控網(wǎng)絡(luò)提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料

挑選籽粒圓潤(rùn)飽滿、大小一致的玉米黃早4 種子，播種于裝有營(yíng)養(yǎng)土的花盆中，在培養(yǎng)室(25 ℃，16 h 光照/8 h 黑暗，相對(duì)濕度70%)中培養(yǎng)至3 葉1 心時(shí)，對(duì)玉米葉進(jìn)行取樣，經(jīng)液氮速凍后放置在-80 ℃超低溫冰箱備用。

1.2 方法

1.2.1 玉米ZmPRR1-1啟動(dòng)子的克隆

按照植物DNA 提取試劑盒(Plant DNA Fastmini Isolation Kit，貝貝生物科技有限公司)說明書提取玉米自交系黃早4 的基因組DNA。在MaizeGDB基因組數(shù)據(jù)庫(https://www.maizegdb.org)中下載玉米自交系CML247 中ZmPRR1-1啟動(dòng)子序列，在ZmPRR1-1基因ATG 上游2 624 bp 處設(shè)計(jì)特異性引物，命名為 ZmPRR -F: 5′ -TCTCGCCCTTACACTTTG-3′、ZmPRR-R:5′-CTATCATTACAAGCCATCGT-3′。以黃早4 的DNA 為模板使用KOD FX 酶進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。其中62 ℃退火30 s，68 ℃延伸2 min 50 s，35 個(gè)循環(huán)。電泳檢測(cè)PCR 產(chǎn)物并回收目的條帶，將其連接到pEasy-BluntSimple 克隆載體上，進(jìn)行后續(xù)測(cè)序。引物合成及產(chǎn)物測(cè)序委托上海生工生物科技有限公司進(jìn)行。

1.2.2 玉米ZmPRR1-1啟動(dòng)子序列的生物信息學(xué)分析

利用DNAMAN 軟件對(duì)玉米CML247 和黃早4的ZmPRR1-1啟動(dòng)子序列進(jìn)行比對(duì)；利用Neural Network Promoter Prediction 預(yù)測(cè)啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)與核心區(qū)域(http://www.fruitfly.org/)；利用PlantCARE 預(yù)測(cè)啟動(dòng)子潛在作用元件(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)；利用PlantRegMap 預(yù)測(cè)啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄結(jié)合位點(diǎn)(http://plantregmap.gao-lab.org/binding_site_prediction.php)，設(shè)置物種為玉米；利用MethPrimer 預(yù)測(cè)啟動(dòng)子區(qū)域可能存在的CpG 島(http://www.urogene.org/cgi-bin/methprimer/methprimer.cgi)。

2 結(jié)果與分析

2.1 玉米ZmPRR1-1 基因啟動(dòng)子的克隆

根據(jù)參考序列在ZmPRR1-1基因ATG 上游2 624 bp 處設(shè)計(jì)特異性引物。以玉米自交系黃早4的DNA 為模板進(jìn)行PCR，電泳后得到一條2 600 bp左右的條帶(圖1)，切膠回收目的片段，轉(zhuǎn)化大腸桿菌挑單克隆測(cè)序。測(cè)序得到2 603 bp 的序列，將測(cè)序結(jié)果與玉米CML247 中ZmPRR1-1基因啟動(dòng)子序列進(jìn)行序列比對(duì)分析(圖2)，二者相似性為98.59%，說明CML247 與黃早4 中ZmPRR1-1的啟動(dòng)子在序列結(jié)構(gòu)上相對(duì)保守。兩者之間的序列存在7 個(gè)單堿基的SNP(單核苷酸多態(tài)性)，1 個(gè)雙堿基的InDel(插入缺失)和2 個(gè)片段的InDel。

圖1 ZmPRR1-1 PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物電泳檢測(cè)結(jié)果Fig.1 Electrophoresis detection results of ZmPRR1-1 PCR amplification products

2.2 玉米ZmPRR1-1 啟動(dòng)子核心區(qū)域預(yù)測(cè)

啟動(dòng)子的核心區(qū)域是保證RNA 聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄正常起始所必需的DNA 序列，它包括轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)和轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游的TATA 區(qū)。基因轉(zhuǎn)錄的起點(diǎn)是指與DNA 堿基互補(bǔ)配對(duì)形成新RNA 的首個(gè)堿基位點(diǎn)。使用BDGP 在線工具進(jìn)行玉米ZmPRR1-1啟動(dòng)子核心區(qū)域的預(yù)測(cè)分析，以預(yù)測(cè)值0.8 作為判斷的截?cái)嘀怠＝Y(jié)果表明玉米ZmPRR1-1啟動(dòng)子中可能存在兩處核心啟動(dòng)子區(qū)域(表1)，分別位于-1 234～-1 184、-250～-200 bp 區(qū)域，預(yù)測(cè)分值分別為:0.94 和0.89，可能的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)分別為:A、G，由于0.94＞0.89，推測(cè)該基因核心啟動(dòng)子區(qū)域很可能位于-1 234～-1 184 bp 處，可能的轉(zhuǎn)錄起始區(qū)域?yàn)?TTTTGTTTATATACATATGAAGGGGTGTATC CCTTGGGAA(A)ATATGTCGT，啟動(dòng)子核心區(qū)域中含有典型的TATA-box 元件。

表1 ZmPRR1-1 啟動(dòng)子核心區(qū)域Table 1 Core region of ZmPRR1-1 Promoter

2.3 玉米ZmPRR1-1 啟動(dòng)子順式作用元件的預(yù)測(cè)

啟動(dòng)子上分布的順式作用元件能有效反映該基因受到外界因子的潛在調(diào)控，所以通過分析啟動(dòng)子的順式作用元件能了解基因可能的調(diào)控機(jī)制及參與的生命活動(dòng)[26]。利用在線分析工具Plant Care 對(duì)得到的ZmPRR1-1啟動(dòng)子序列進(jìn)行順式作用元件分析(圖2)，結(jié)果表明:ZmPRR1-1啟動(dòng)子序列中存在豐富且類型多樣的順式作用元件，除了TATA-box(25 個(gè))、CAAT-box(25 個(gè))等基本轉(zhuǎn)錄元件外，還存在多種順式作用元件與光響應(yīng)有關(guān)，例如ACE(1個(gè))、AE-box(1 個(gè))、AT1-motif(1 個(gè))、G-box(9個(gè))、Sp1(2 個(gè))，暗示玉米ZmPRR1-1啟動(dòng)子對(duì)光因素存在多種響應(yīng)方式[27]。其次，ZmPRR1-1啟動(dòng)子中還存在多種激素應(yīng)答元件，如脫落酸應(yīng)答元件ABRE(8 個(gè))、赤霉素應(yīng)答元件P-box(1 個(gè))、水楊酸響應(yīng)元件TCA-element(1 個(gè))、生長(zhǎng)素響應(yīng)元件TGA-box(1 個(gè))、茉莉酸甲酯響應(yīng)元件CGTCA-motif(1 個(gè))和TGACG-motif(3 個(gè))。另外也存在脅迫相關(guān)的順式作用元件包括干旱誘導(dǎo)元件MBS(1個(gè))、缺氧特異性誘導(dǎo)元件GC-motif(4 個(gè))。當(dāng)外界環(huán)境因子發(fā)生變化時(shí)，這些元件會(huì)發(fā)生反應(yīng)，提高植物抗逆性。另外，還鑒定到參與細(xì)胞周期的順式元件MSA-like(2 個(gè))；參與玉米醇溶蛋白代謝調(diào)控元件O2-site(1 個(gè))；參與防御和應(yīng)激反應(yīng)的調(diào)控元件TC-rich repeats(1 個(gè))以及一些未知元件。

圖2 CML247 與黃早4 ZmPRR1-1 基因的啟動(dòng)子序列比對(duì)結(jié)果Fig.2 Results of promoter sequence alignment between CML 247 and Huangzao4 ZmPRR1-1

圖3 ZmPRR1-1 啟動(dòng)子順式作用元件預(yù)測(cè)Fig.3 Prediction of cis-acting elements of ZmPRR1-1 promoter

通過序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，CML247 和黃早4 中Zm-PRR1-1啟動(dòng)子共享眾多順式元件，暗示兩種自交系中ZmPRR1-1的啟動(dòng)子可能有相似的調(diào)控機(jī)制與基因功能。與CML247 相比，黃早4 中ZmPRR1-1啟動(dòng)子在ATG 上游2 104 bp 處堿基發(fā)生T→G 的單堿基突變，導(dǎo)致了在黃早4 中ZmPRR1-1啟動(dòng)子調(diào)控區(qū)域出現(xiàn)新的G-box 元件。

以上分析表明，玉米ZmPRR1-1基因啟動(dòng)子可受多種外界信號(hào)或轉(zhuǎn)錄因子的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，調(diào)節(jié)玉米ZmPRR1-1基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，并可能參與植物光周期、生長(zhǎng)發(fā)育、逆境脅迫和激素誘導(dǎo)響應(yīng)等多種生命活動(dòng)及生理過程。

2.4 玉米ZmPRR1-1 啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合位點(diǎn)預(yù)測(cè)分析

啟動(dòng)子上的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)TFBS(transcription factor binding site)是與轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合的DNA 片段，它們是轉(zhuǎn)錄開始的關(guān)鍵結(jié)合部位[27]。研究表明TFBS 具有保守性[28]，有相同或相似的序列就可結(jié)合相同的轉(zhuǎn)錄因子[29]。使用PlantRegMap 在線工具對(duì)ZmPRR1-1啟動(dòng)子的TFBS 進(jìn)行預(yù)測(cè)，預(yù)測(cè)結(jié)果表明存在33 個(gè)TFBS，涉及到ERF、LBD、BBRBPC、MIKC_MADS、WRKY 和GRAS 共6 種轉(zhuǎn)錄因子家族，其中ERF 家族的結(jié)合位點(diǎn)出現(xiàn)頻率最高，出現(xiàn)了23 次。預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)這些TFBS 分布在ZmPRR1-1基因啟動(dòng)子的正負(fù)鏈上，推測(cè)該啟動(dòng)子具有豐富的調(diào)控機(jī)制，啟動(dòng)ZmPRR1-1基因的表達(dá)，并通過調(diào)節(jié)不同轉(zhuǎn)錄因子家族的轉(zhuǎn)錄起始參與行使不同的生物學(xué)功能。

表2 ZmPRR1-1 啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合位點(diǎn)預(yù)測(cè)Table 2 Prediction of binding sites of transcription factors of ZmPRR1-1 promoter

2.5 玉米ZmPRR1-1 啟動(dòng)子CpG 島的預(yù)測(cè)

基因上富含連續(xù)未甲基化CG 堿基的區(qū)域稱為CpG 島，主要存在于基因的啟動(dòng)子和外顯子上，研究發(fā)現(xiàn)啟動(dòng)子CpG 島影響基因表達(dá)效率以及表達(dá)水平。使用MethPrimer 在線工具預(yù)測(cè)玉米ZmPRR1-1啟動(dòng)子的CpG 島，預(yù)測(cè)CpG 島參數(shù)設(shè)置為GC ＝50%，ObsCpG/ExpCpG＝0.6，長(zhǎng)度＝100 bp。預(yù)測(cè)分析顯示，玉米ZmPRR1-1啟動(dòng)子序列存在4 個(gè)CpG島分布區(qū)域，分布區(qū)域分別位于-2 329～-1 921、-1 716～-1 332、-910～-740、-696～-53 bp，長(zhǎng)度分別為409、385、171、644 bp(圖4)。暗示這些區(qū)域可能對(duì)啟動(dòng)子調(diào)控基因產(chǎn)生一定的影響。

圖4 ZmPRR1-1 啟動(dòng)子CpG 島預(yù)測(cè)Fig.4 Prediction of CpG island of ZmPRR1-1 promoter

3 討論

PRR 家族基因是中央振蕩器的重要組成部分，參與到植物光周期控制的開花途徑中，并發(fā)揮負(fù)向調(diào)節(jié)作用，且可通過調(diào)控脫落酸的合成，影響植物抗逆性，調(diào)控植物光周期控制的開花和生長(zhǎng)發(fā)育。Alabadi 等[20]在擬南芥中發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)TOC1會(huì)使CCA1、LHY表達(dá)量維持較高水平，減少mRNA 信號(hào)，從而導(dǎo)致負(fù)反饋回路。Klein 等[30]發(fā)現(xiàn)，TOC1能夠結(jié)合到ABA 基因啟動(dòng)子上抑制ABAR、CBF、ABI3 等基因表達(dá)，進(jìn)而影響擬南芥的生物鐘。本研究通過克隆玉米自交系黃早4 的ZmPRR1-1啟動(dòng)子，采用生物信息學(xué)方法對(duì)ZmPRR1-1啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)及核心區(qū)域、順式作用元件、轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)及CpG 島進(jìn)行預(yù)測(cè)及分析，結(jié)果表明ZmPRR1-1的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)位于ATG 上游1 175 bp 的A，附近有赤霉素響應(yīng)元件ABRE 和光響應(yīng)元件AT1-motif，暗示赤霉素合成與光周期調(diào)控可能是ZmPRR1-1參與的兩個(gè)重要生長(zhǎng)調(diào)節(jié)途徑。而在轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游發(fā)現(xiàn)ERF 結(jié)合位點(diǎn)，ZmPRR1-1可能通過調(diào)控ERF 起始轉(zhuǎn)錄參與生命活動(dòng)。此外，在其附近沒有發(fā)現(xiàn)CpG 島區(qū)域，此基因甲基化調(diào)控不受核心區(qū)域影響。

TATA-box 作為核心啟動(dòng)子元件，可以被RNA聚合酶識(shí)別調(diào)控轉(zhuǎn)錄起始。順式作用元件分析顯示，ZmPRR1-1基因啟動(dòng)子具有典型高活性啟動(dòng)子具備的TATA-box 和CAAT-box 等基本元件；由于順式作用元件影響，植物逆境脅迫誘導(dǎo)的基因表達(dá)存在多種響應(yīng)方式[31]。在ZmPRR1-1啟動(dòng)子中鑒定到4 種光響應(yīng)元件，表明玉米ZmPRR1-1啟動(dòng)子對(duì)光因素可能存在多種響應(yīng)方式，光響應(yīng)元件在啟動(dòng)子調(diào)控區(qū)域的富集也與ZmPRR1-1在光周期中的重要作用相匹配。有研究表明，脫落酸應(yīng)答元件ABRE 在脫落酸存在的情況下與轉(zhuǎn)錄因子EmBP-1相互作用能顯著增強(qiáng)Em基因的表達(dá)，從而提高小麥的抗旱性[32]；干旱脅迫下，玉米中脫落酸誘導(dǎo)ZmPYL9基因表達(dá)，增強(qiáng)玉米抗旱能力[33]；脫落酸還能增加玉米可溶性糖的含量，提高玉米品質(zhì)[34]。Shakirova 等[35]發(fā)現(xiàn)，水楊酸可通過改善玉米的滲透調(diào)節(jié)能力和加速淀粉轉(zhuǎn)化來緩解低溫脅迫誘導(dǎo)的氧化損傷。許高平等[36]的研究表明，赤霉素可有效提高玉米幼苗的抗寒抗旱能力。本研究發(fā)現(xiàn)，Zm-PRR1-1啟動(dòng)子存在多種激素響應(yīng)元件，如脫落酸響應(yīng)元件ABRE、水楊酸反應(yīng)元件TCA-element 和赤霉素反應(yīng)元件P-box，暗示ZmPRR1-1可能通過參與脫落酸、水楊酸和赤霉素合成來調(diào)控植物生長(zhǎng)發(fā)育。CML247 與黃早4 中ZmPRR1-1的啟動(dòng)子序列有98.59%的同源性，暗示兩自交系中ZmPRR1-1的啟動(dòng)子存在相似的調(diào)節(jié)模式和功能。該啟動(dòng)子中，有Sp1 和GC-motif 兩種順式作用元件位于ERF轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合區(qū)域內(nèi)，是兩種擁有轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)的順式元件，推測(cè)ZmPRR1-1可能通過調(diào)控ERF起始轉(zhuǎn)錄，參與調(diào)節(jié)玉米的生長(zhǎng)發(fā)育。

結(jié)合位點(diǎn)分析結(jié)果表明，ZmPRR1-1的啟動(dòng)子可以與ERF、LBD、BBR-BPC、MIKC_MADS、WRKY和GRAS等多種轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合共同作用影響玉米生長(zhǎng)，眾多結(jié)合位點(diǎn)位于CpG 島區(qū)域內(nèi)，暗示Zm-PRR1-1的啟動(dòng)子調(diào)控轉(zhuǎn)錄起始受甲基化影響。

啟動(dòng)子根據(jù)是否含有CpG 島可分為CpG 島啟動(dòng)子和非CpG 島啟動(dòng)子，啟動(dòng)子CpG 島調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄，影響轉(zhuǎn)錄效率和轉(zhuǎn)錄水平。CpG 島預(yù)測(cè)Zm-PRR1-1啟動(dòng)子序列中有4 個(gè)CpG 島，CpG 島中存在數(shù)量眾多的順式作用元件，推測(cè)ZmPRR1-1啟動(dòng)子調(diào)控轉(zhuǎn)錄起始可能受甲基化影響。

4 結(jié)論

本研究克隆了玉米自交系黃早4 中ZmPRR1-1的啟動(dòng)子，同時(shí)對(duì)啟動(dòng)子核心區(qū)域、順式作用元件、轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)和CpG 島進(jìn)行分析。啟動(dòng)子中既含有核心啟動(dòng)子元件，也含有多個(gè)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)。表明:(1)ZmPRR1-1的啟動(dòng)子具有基本啟動(dòng)子活性和調(diào)控轉(zhuǎn)錄起始的功能。(2)ZmPRR1-1啟動(dòng)子區(qū)域富含多種順式元件，暗示該基因啟動(dòng)子除響應(yīng)光周期重要調(diào)控外，還可能響應(yīng)干旱、缺氧等脅迫，推測(cè)ZmPRR1-1具有一因多效功能。綜合數(shù)據(jù)及研究結(jié)果表明，克隆得到的ZmPRR1-1基因啟動(dòng)子具有控制轉(zhuǎn)錄起始及調(diào)控多樣性的能力。相關(guān)結(jié)果為進(jìn)一步研究該基因的功能提供了研究方向，為進(jìn)一步解析ZmPRR1-1啟動(dòng)子調(diào)控機(jī)制、基因功能及基因上游調(diào)控網(wǎng)絡(luò)奠定了基礎(chǔ)。