青蒿琥酯通過FABP5調節PI3K/AKT通路影響肝癌細胞的增殖和遷移

王清森，吳 靜,3，周家偉，劉亞鋒，成安琪，胡 東,3

肝細胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是發病率和死亡率較高的惡性腫瘤之一[1]，許多國家的發病率和死亡率還在持續上升[2]。多項研究[3-4]提出了包含年齡、性別和腫瘤分級等在內的預后因素，用于預測HCC患者的生存狀態，但目前HCC的發病機制仍未完全闡明。近年來，靶向藥物治療HCC獲得了很多突破性進展，索拉非尼、青蒿琥酯(artesunate，ART)、吉非替尼等都體現出了治療HCC的潛力[5-6]。但目前HCC全身治療藥物的療效仍不能讓人滿意，這需要更加深入地研究HCC發生發展機制，探尋藥物的新靶點。前期研究[7]表明ART可以聯合索拉非尼抑制HCC的進展，該研究通過網絡藥理學和生物信息學對ART治療HCC的潛在靶點和詳細分子機制進行深入探討，并通過實驗證明ART的詳細作用機制及通路，為臨床治療HCC提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料SK-HEP-1細胞為安徽理工大學醫學院常規保存；ART(大連美侖生物技術有限公司)；DMEM培養基、胰酶和優質胎牛血清(美國Gibco公司)；6孔細胞培養皿(美國Corning公司)；TRIzol試劑、逆轉錄試劑盒(賽默飛世爾科技中國有限公司)；熒光定量PCR試劑盒(武漢愛博泰克生物科技有限公司)；引物由生工生物工程(上海)有限公司合成；RIPA裂解液、5×SDS上樣緩沖液、SDS-PAGE凝膠配制試劑盒(上海碧云天生物技術公司)；PVDF膜和ECL曝光液(美國Millipore公司)；FABP5兔單克隆抗體(美國CST公司，#39926T)，PI3K兔單克隆抗體(美國Abcam公司，#ab32089)，p-PI3K兔單克隆抗體(美國Abcam公司，#ab278545)，AKT兔單克隆抗體(美國CST公司，#4685S),p-AKT兔單克隆抗體(美國CST公司，#4060T)，β-actin兔多克隆抗體(武漢愛博泰克生物科技有限公司，#AC026)；辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG二抗(賽默飛世爾科技中國有限公司，#C31460)。MTS試劑盒[普洛麥格(北京)生物技術有限公司，#G3580]。高速臺式冷凍離心機(德國Eppendorf公司,型號：centrifuge 5417R)；酶標儀(美國Agilent公司，型號：Epoch 2)；梯度基因擴增儀(珠海黑馬醫學儀器有限公司，型號:Hema 9600)；實時熒光定量PCR儀(賽默飛世爾科技中國有限公司，型號：Quantstudio 3)；凝膠成像儀(英國Amersham公司，型號：ImageQuant 800)；倒置熒光顯微鏡(德國Leica公司，型號：DMi8)。

1.2 方法

1.2.1ART靶點預測 從PubChem數據庫(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)下載藥物ART的3D結構， 將藥物3D結構上傳到PharmMapper(http://www.lilab-ecust.cn/pharmmapper/)數據庫(PharmMapper數據庫是基于藥物的效應基團的立體結構來篩選其潛在的特異性靶標，找到藥物分子-潛在靶標之間最佳的映射姿勢，是重要的計算釣靶服務器[8])，運行得到CSV格式結果文件。將所得到的靶點基因導入 UniProt 數據庫，限定物種為“human”，將檢索得到的所有蛋白靶標校正為UniProt ID，并得到靶標蛋白所對應的基因名。

1.2.2藥物-靶點相互作用網絡構建 把所有ART對應的靶點基因導入STRING數據庫(https://string-db.org/)，限定物種“Homo sapiens”，并以置信度≥0.8，隱藏離散的點，得到潛在作用靶點與藥物互作關系。隨后在Cytoscape 3.6.1軟件中將藥物-靶點互作網絡可視化。

1.2.3TCGA數據庫分析 從癌癥基因組圖譜數據庫(TCGA，https://portal.g dc.Cancer.gov/)下載50例HCC癌旁樣本和374例HCC樣本的RNA測序數據集以及相應的臨床數據。提取靶點基因在HCC中的表達量，用R包(limma和pheatmap)提取差異表達基因，做出基因差異表達熱圖和火山圖。對差異表達基因進行COX單因素和多因素回歸分析，篩選關鍵靶點基因。

1.2.4分子對接 從ZINC(http://zinc.docking.org/)數據庫下載ART的mol2格式文件。從 PDB 數據庫下載靶標的晶體結構，并運用PyMOL軟件進行預處理，包括去除水分子、加氫等。利用 Auto Dock Tools軟件將靶標晶體結構轉換為 pdbqt 格式文件，并導入ART的mol2格式文件，隨后進行分子對接[9]。通過結合能評價ART和靶點的結合活性，最后運用 PyMOL 軟件使對接文件可視化。

1.2.5GEPIA2數據庫驗證 從GEPIA2數據庫(http://gepia2.cancer-pku.cn/#index)驗證關鍵靶點基因在肝癌組織和正常組織中的表達，并對關鍵靶點基因進行預后分析。

1.2.6靶點通路富集分析 利用R包(clusterProfiler)對獲得的靶標進行KEGG 通路分析，進一步研究ART作用于HCC細胞的分子機制。

1.2.7劃痕實驗 收集處于對數生長期的SK-HEP-1細胞，以5×105個/ml分別接種于細胞培養皿中，對照組加DMSO，實驗組加100 μmol/L ART，直至90%融合，用10 μl無菌槍頭比著直尺用力劃橫線；無菌 PBS 輕輕沖洗細胞3次，洗去脫落的細胞，加入無血清培養基，繼續培養24、48 h，分別于0、24、48 h拍攝圖像。

1.2.8MTS實驗 收集處于對數生長期的SK-HEP-1細胞，以每孔5×103個接種于96孔板中，每組設置3個復孔。待細胞貼壁后，實驗組加入100 μmol/L ART,對照組加入DMSO，放入37 ℃、5% CO2培養箱中分別培養 24、48、72 h后，向每孔加入20 μl MTS繼續培養4 h。然后再用酶標儀測定 490 nm處的吸光度，該實驗重復3次。

1.2.9實時熒光定量PCR 使用TRIzol試劑提取細胞總RNA成分，逆轉錄獲得cDNA，存于-20 ℃冰箱備用。使用SYBR Green試劑盒在熒光定量PCR儀上進行qRT-PCR檢測。使用GAPDH作為內參基因。FABP5上游引物為5′-TGAAGGAGCTA GGAGTGGGAA-3′,下游引物為5′-TGCACCATCTGTAAAGTTGCAG-3′,產物長度212 bp；GAPDH上游引物為5′-CTGGGCTACACTGAGCACC-3′,下游引物為5′-AAGTGGTCGTTGAGGGAATG-3′，產物長度101 bp。實驗重復3次。實驗中樣本基因的Ct值通過GAPDH的Ct值均一化，即△Ct=Ct樣本-Ct內參，樣本基因mRNA相對豐度值以 2-△△Ct值表示。

1.2.10蛋白提取與Western blot 實驗 將未處理和加ART處理的SK-HEP-1細胞加RIPA裂解液提取總蛋白，等量的細胞總蛋白經SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離后，轉印至PVDF膜。轉膜后于5%脫脂奶粉中室溫封閉1 h，分別孵育anti-FABP5(1 ∶1 000)，anti-p-PI3K(1 ∶2 000)，anti-PI3K(1 ∶1 000)，anti-p-AKT(1 ∶2 000)，anti-AKT(1 ∶1 000)，anti-β-actin(1 ∶50 000)一抗于4 ℃孵育過夜。隔天洗膜后，室溫孵育辣根過氧化物酶偶聯的羊抗兔二抗(1 ∶20 000)1 h。洗膜后采用 ECL發光液成像系統檢測。采用ImageJ軟件進行圖像分析，β-actin為內參。

1.3 統計學處理采用 GraphPad Prism 8.0.1版本進行統計學分析。每一個實驗至少經過3次重復驗證，使用兩樣本t檢驗方法分析比較兩組間的差異，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 藥物作用靶點的獲取通過PharmMapper數據庫得到ART的靶點基因，ART靶點基因299個。根據UniProt數據庫查詢到的蛋白質，對ART的作用靶點進行注釋，篩去UniProt數據庫中不包含的作用靶點，最終獲得ART的靶點數為282個。

2.2 藥物-靶點相互作用網絡構建將藥物靶點整合后，導入STRING數據庫中，限定物種“Homo sapiens”，設置置信度≥0.8，隱藏離散的點，得到162個潛在靶點蛋白，565條相互作用關系。下載PPI信息，將文件導入Cytoscape軟件中可視化，得到藥物-靶點相互作用網絡(圖1)。

圖1 藥物-靶點PPI互作網絡

2.3 HCC中關鍵靶點基因篩選從TCGA下載的HCC數據中提取ART靶點基因的數據，獲得278個靶點基因，用R包分析278個靶點基因在HCC中的差異表達水平，篩選出37個差異表達靶點基因(圖2A)，上調基因和下調基因(圖2B)。接著對37個差異表達基因進行單因素和多因素COX回歸分析，單因素篩選出6個差異表達靶點基因，多因素篩選出3個差異表達靶點基因(圖2C、D)。

圖2 HCC中差異表達基因分析

2.4 FABP5的結合能最高利用Auto Dock Tools軟件將ART和對應的3個靶點基因分別進行分子對接。可以看出ART與FABP5 的結合能最大，ART最有可能與FABP5結合(表1，圖3)。

圖3 分子對接

表1 ART與關鍵靶點蛋白對接結果

2.5 FABP5在肝細胞癌中更具有預后價值GEPIA2 數據庫分析發現LIHC患者中，FABP5在癌組織中的表達量顯著高于正常組織且差異有統計學意義(圖4A)。MMP12在癌組織中的表達量也高于正常組織但差異無統計學意義(圖4B)。TNNC1在正常組織中高表達，但差異無統計學意義(圖4C)。GEPIA2數據庫預后分析發現FABP5高表達與患者總生存率(overall survival，OS)低顯著相關(P=0.001 1)(圖4D)。MMP12(P=0.022 0)(圖4E)、TNNC1(P=0.009 5)(圖4F)高表達與患者OS低也相關，但FABP5更顯著。

圖4 GEPIA2數據庫差異表達和生存分析

2.6 靶點基因通路富集分析將ART的靶點基因通過R語言進行KEGG通路分析，這些基因參與的主要通路包括PI3K/AKT信號通路、脂質和動脈粥樣硬化(lipid and atherosclerosis)通路、前列腺癌(prostate cancer)通路，其中FABP5富集在PI3K/AKT信號通路(圖5)。

圖5 靶點基因通路富集分析

2.7 ART可能通過FABP5抑制PI3K/AKT信號通路進而抑制肝癌細胞增殖和遷移劃痕實驗顯示，與對照組比較，SK-HEP-1細胞加入ART刺激 48 h后顯著抑制細胞遷移(圖6A)。MTS實驗表明，與對照組比較，ART組能顯著抑制細胞增殖(圖6B)。qRT-PCR結果顯示，與對照組比較，SK-HEP-1細胞加入ART刺激48 h后，FABP5表達水平下降(圖6C)。Western blot結果顯示，與對照組比較，SK-HEP-1細胞加入ART之后，FABP5的蛋白水平下降；p-PI3K和p-AKT的磷酸化水平下降(圖6D)。

圖6 ART對肝癌細胞增殖、遷移及對FABP5、p-PI3K、p-AKT表達水平的影響

3 討論

近年來，雖然靶向藥物治療HCC已經獲得了突破性進展，但目前HCC全身治療藥物的效果仍不能讓人滿意。前期研究[7]發現ART可以通過增強索拉非尼的藥物敏感性，從而用于治療HCC，但ART是否可以治療HCC以及其潛在靶標和機制仍不明確，需要進一步研究。

基于網絡藥理學具有對“藥物-靶點-疾病”進行網絡分析，從而系統找出藥物與靶點之間的對應關系，并揭示多種藥物協同作用的優勢。已有大量研究[10-12]利用生物信息學、網絡藥理學等方法篩選藥物潛在靶點，并將藥物與靶點進行分子對接后分析其詳細作用機制。本研究借助網絡藥理學的方法，對ART的潛在靶點進行篩選，共篩選出282個靶點基因，利用Cytoscape軟件將靶點基因進行可視化。隨后，下載TCGA數據庫中HCC測序數據，對靶點基因進行差異表達分析，單-多因素回歸分析，篩選出3個關鍵靶點基因，分別是TNNC1、MMP12、FABP5。有研究[13]表明TNNC1在HCC中高表達，而TNNC1的高表達會促進肝癌細胞遷移。MMP12可能通過增加腫瘤組織中FOXP3+Treg的浸潤水平，促進HCC的發生發展及免疫逃避[14]。研究發現，FABP5和多種腫瘤的發生發展密切相關，如FABP5可通過PI3K/AKT信號通路調節腎透明細胞癌細胞增殖[15]，促進腎癌細胞生長和轉移[16]，影響腎癌的進展。FABP5可通過調節肺內自然殺傷細胞的成熟控制肺癌細胞轉移[17]。FABP5可促進前列腺癌細胞增殖[18-19]。FABP5在肝內膽管癌聯合淋巴結轉移中顯著過表達，并參與體外細胞增殖和侵襲,表明 FABP5可能與肝內膽管癌的進展有關[20]。但是，FABP5在肝癌中卻鮮有研究。

利用Auto Dock Tools軟件對ART和3個關鍵靶點分別進行分子對接，結果顯示ART和FABP5的結合能最大(-8.77)，說明ART和FABP5蛋白的結合效能最高，提示FABP5可能是ART治療HCC的潛在作用靶點。利用GEPIA2數據庫對3個關鍵靶點基因在HCC中的表達及預后進行分析，發現只有FABP5具有差異和預后的雙重特性，進一步證實FABP5在HCC的發生發展中起著關鍵作用。通過KEGG通路富集分析發現FABP5主要富集在PI3K/AKT通路，提示ART可能通過調節 PI3K/AKT信號通路影響HCC。細胞實驗證實ART可以抑制SK-HEP-1細胞增殖和遷移，ART可能是通過影響FABP5的表達水平，進而影響PI3K/AKT信號通路抑制肝癌細胞的增殖和遷移。

本研究也有局限性。首先，只在細胞水平上進行了驗證，沒有臨床樣本進行驗證，需要更多前瞻性的真實數據來驗證其臨床實用性。其次，只證明了ART可能與FABP5結合，但它們結合的機制尚不清楚。

綜上所述，篩選出FABP5可能作為ART的作用靶點，FABP5為PI3K/AKT信號通路的上游。ART通過抑制FABP5的表達抑制PI3K/AKT信號通路，進而抑制肝癌細胞的增殖和遷移。HCC中ART與靶點基因之間的內在機制尚不清楚，值得進一步研究。