羊毛固醇合成酶雜合敲除小鼠全腦轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析

李艷玲，李昱昊，孫曉梅，張 軍，張素梅，張勝權(quán)

膽固醇是哺乳動(dòng)物細(xì)胞中重要的脂質(zhì)分子，可以調(diào)節(jié)生物膜的流動(dòng)性[1]。膽固醇在體內(nèi)可以轉(zhuǎn)化成類固醇激素、膽汁酸和氧化固醇調(diào)控機(jī)體的生長(zhǎng)發(fā)育等生理過(guò)程。膽固醇代謝異常參與了動(dòng)脈粥樣硬化、癌癥、阿爾茨海默病和其他神經(jīng)退行性疾病的發(fā)生發(fā)展。羊毛固醇合成酶(lanosterol synthase，LSS)催化(S)-2，3-氧化喹烯環(huán)化合成羊甾醇形成甾醇核的反應(yīng)[2]。Mori et al[3]證實(shí)LSS基因的錯(cuò)義突變可導(dǎo)致先天性白內(nèi)障。羊毛固醇轉(zhuǎn)化為膽固醇有兩種途徑：Bloch途徑和Kandutsch Russell途徑。在小鼠中，Bloch途徑介導(dǎo)了睪丸、脾臟和腎上腺中90%或更多的膽固醇生物合成，而大腦70%以上的膽固醇生物合成來(lái)自腦星型膠質(zhì)細(xì)胞[4]。該研究通過(guò)LSS(+/-)小鼠與野生型(wide type，WT)小鼠全腦基因表達(dá)譜分析，經(jīng)過(guò)數(shù)據(jù)篩選和基因表達(dá)譜的聚類分析，找出差異表達(dá)基因，為進(jìn)一步研究膽固醇代謝對(duì)動(dòng)物行為學(xué)的影響及在神經(jīng)系統(tǒng)疾病中的作用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物委托南京生物醫(yī)藥研究所構(gòu)建LSS(+/-)小鼠，回交繁殖，取8周齡LSS(+/-)雌鼠及WT雌鼠全腦組織委托華大基因公司進(jìn)行RNA-Seq分析(n=3)，同時(shí)取全腦組織進(jìn)行實(shí)時(shí)定量熒光PCR及Western blot分析。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方案符合安徽醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)相關(guān)規(guī)定。

1.2 試劑裂解液 RIPA、SDS-PAGE(5×)、Trizol、蛋白預(yù)染 Mark 購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司；Tris、甘氨酸、SDS 購(gòu)自上海生物工程有限公司；Tween-20 購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；抗體稀釋液購(gòu)自美國(guó)TOYOBO 公司；10×Loading Buffer、 DL2000 DNA Ladder 購(gòu)自美國(guó)TAKARA 公司；蛋白胨、瓊脂粉、蛋白胨購(gòu)自美國(guó)OXOID公司；EB購(gòu)自賽百盛基因技術(shù)有限公司；鼠尾基因鑒定試劑盒購(gòu)自上海碧云天生物有限公司。

1.3 小鼠基因組DNA提取剪取小鼠尾尖3～5 mm放入1.5 ml EP管中，實(shí)驗(yàn)試劑按照比例將DNA Extraction Solution 和 Enzyme Mix 充分混勻，取0.5 ml消化液加入EP管中，55 ℃，3～5 h。15 000 r/min離心，10 min。取上清液0.4 ml，加入異丙醇，上下顛倒10次，4 ℃，15 000 r/min離心，5 min。去上清，濾紙吸干，加入70%乙醇溶液，將管底沉淀彈起，洗滌。離心，去上清液，空氣干燥5～10 min，加入1×TE約100 μl，震蕩30 min，于4 ℃保存。具體方法按試劑盒說(shuō)明書操作。

1.4 PCR擴(kuò)增反應(yīng)PCR是以單鏈DNA為模板，4種dNTP為底物，在有引物存在的情況下，進(jìn)行互補(bǔ)鏈的延伸，反復(fù)的循環(huán)能使模板DNA得到極大的擴(kuò)增。于離心管中，加入Premix Taq(TaKaRaTaq Version 2.0 Plus dye) 15 μl、R引物1 μl孔 DNA模板1 μl、F 引物1 μl、加入雙蒸水補(bǔ)足至30 μl。在Taq DNA聚合酶的催化下，以dNTP為原料，引物沿5′→3′方向延伸，形成新的DNA片段，如此重復(fù)改變溫度，使目的基因得以迅速擴(kuò)增。引物是由南京大學(xué)南京生物醫(yī)藥研究所設(shè)計(jì)，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，LSS基因引物分別是ACCTGGGCGGAGTCTAAGGAAG(上游)和AAGGCTCTCCACTGTTTCAGAGCT(下游)。

1.5 瓊脂糖凝膠電泳和基因型結(jié)果判斷取0.24 g瓊脂糖加入25 ml 1×TAE電泳緩沖液中，加熱至完全溶解，稍冷卻至不燙手，加入2 μl EB，上樣DNA樣本5 μl，電泳電壓90 V，時(shí)間90 min，于化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)中拍照觀察。擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為328 bp左右條帶為WT小鼠；擴(kuò)增產(chǎn)物有282 bp和328 bp兩條電泳條帶則為雜合敲除小鼠LSS(+/-)。

1.6 RNA-Seq分析取8周齡LSS敲除(+/-)小鼠與WT C57BL/6雌鼠各3只，水合氯醛麻醉處死，取全腦，提取總RNA，委托華大基因公司進(jìn)行RNA-Seq分析。

1.7 實(shí)時(shí)定量熒光PCR分析取小鼠尾部組織，提取和反轉(zhuǎn)錄RNA，PCR擴(kuò)增。配置PCR反應(yīng)液，冰上操作。考慮到加樣誤差，PCR反應(yīng)液應(yīng)比實(shí)際需要多配置一些體積。將配完的反應(yīng)液分裝至反應(yīng)板或微量離心管中。蓋上管蓋，確保封嚴(yán)。為避免干擾PCR儀讀取熒光信號(hào)，應(yīng)謹(jǐn)慎選擇在反應(yīng)板或離心管上標(biāo)記的位置，使用離心機(jī)高速瞬離。將反應(yīng)板放入實(shí)時(shí)定量熒光 PCR擴(kuò)增儀中。根據(jù)說(shuō)明書設(shè)定反應(yīng)程序。反應(yīng)結(jié)束后確認(rèn)擴(kuò)增曲線和融解曲線。導(dǎo)出、拷貝數(shù)據(jù)，計(jì)算、統(tǒng)計(jì)結(jié)果。結(jié)果以2-ΔΔCt方法計(jì)算。

1.8 Western blot 檢測(cè)腦組織中LSS蛋白的表達(dá)取全腦組織置于離心管中，加入裂解液和蛋白酶抑制劑，勻漿機(jī)破碎組織，提取全腦組織總蛋白。用蛋白濃度測(cè)定試劑(BCA法)進(jìn)行蛋白定量，取蛋白樣品加入上樣緩沖液，煮沸。保存于-20 ℃冰箱。配置10%聚丙烯酰胺凝膠，蛋白樣品上樣，電泳1 h后轉(zhuǎn)膜，轉(zhuǎn)膜后牛奶封閉，一抗(1 ∶1 000) 4 ℃過(guò)夜,次日用1×TBS-T 洗膜3次,加二抗室溫2 h,1×TBS-T洗膜3次。 ECL 化學(xué)發(fā)光試劑進(jìn)行顯影,軟件測(cè)定吸光度值以計(jì)算蛋白表達(dá)。

1.9 基因表達(dá)譜分析技術(shù)以biotinylated oligo(dT)為引物反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，用限制性內(nèi)切酶酶切。通過(guò)鏈霉抗生物素蛋白珠收集cDNA 3′端部分。對(duì)每一個(gè)mRNA只收集其polyA尾與最近的酶切位點(diǎn)之間的片段。將cDNA等分為A和B兩部分，分別連接接頭A或接頭B。接頭的結(jié)構(gòu)為引物A/B序列+標(biāo)簽酶識(shí)別位點(diǎn)+錨定酶識(shí)別位點(diǎn)。用標(biāo)簽酶酶切產(chǎn)生連有接頭的短cDNA片段(約9～10堿基)，混合并連接兩個(gè)cDNA池的短cDNA片段，構(gòu)成雙標(biāo)簽后，用引物A和B擴(kuò)增。

2 結(jié)果

2.1 C57BL/6小鼠基因型鑒定LSS敲除(+/-)小鼠回交繁殖的子代8周齡雌鼠，剪尾提取基因組DNA、PCR及瓊脂糖電泳分析結(jié)果見圖1。LSS敲除(+/-)小鼠的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為兩條帶，大小分別為282 bp和328 bp，而WT小鼠僅一條帶為328 bp。圖1中3、4、7、10號(hào)為L(zhǎng)SS(+/-)小鼠，而2、6、8及11～18號(hào)為WT小鼠；1、5、9號(hào)小鼠需重新鑒定。

圖1 小鼠基因型鑒定PCR擴(kuò)增產(chǎn)物瓊脂糖電泳結(jié)果

2.2 RNA-Seq分析結(jié)果選取8周齡LSS敲除(+/-)小鼠及C57BL/6小鼠各3只，取全腦提取總RNA進(jìn)行RNA-Seq分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩組間存在320個(gè)差異基因(P<0.05)，見圖2，其中上調(diào)基因 145個(gè)，下調(diào)175個(gè)。使用 R 軟件中的 phyper 函數(shù)進(jìn)行富集分析，計(jì)算 P值，然后對(duì)P值進(jìn)行 FDR 校正得到Q值，Q≤0.05的功能視為顯著富集。KEGG 通路富集及網(wǎng)絡(luò)互作分析發(fā)現(xiàn)，差異基因表達(dá)與神經(jīng)活化的受體與配體通路(16個(gè)基因)、河馬信號(hào)途經(jīng)(7個(gè)基因)及谷氨酸能突觸途徑(9個(gè)基因)有關(guān)，見圖3、4。

圖2 LSS敲除(+/-)小鼠及C57BL/6小鼠差異表達(dá)基因熱圖

圖3 差異基因KEGG富集結(jié)果

2.3 實(shí)時(shí)定量熒光PCR技術(shù)分析LSS(+/-)及WT小鼠全腦RNA-Seq為了進(jìn)一步驗(yàn)證RNA-Seq分析的結(jié)果，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)實(shí)時(shí)定量熒光PCR技不同形狀表示不同的內(nèi)容(節(jié)點(diǎn)，node)，方塊表示KEGG Pathway，圓形表示mRNA；顏色和大小都表示與該節(jié)點(diǎn)連接的基因或轉(zhuǎn)錄本數(shù)；顏色越深、方塊越大，表示與該節(jié)點(diǎn)連接的基因或轉(zhuǎn)錄本越多術(shù)分析LSS(+/-)小鼠及WT C57BL/6小鼠全腦mRNA，結(jié)果提示，與WT小鼠比較，LSS(+/-)小鼠中CCKBR與Htr5b的表達(dá)分別上調(diào)約8倍及6倍， 而Gri2c、Drd2、Grm4及Adora2d表達(dá)均下調(diào)，這些基因中大部分與情緒相關(guān)，提示其可能影響小鼠的情緒，見圖5。

圖4 差異表達(dá)基因網(wǎng)絡(luò)互作圖

圖5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析結(jié)果

2.4 CCKBR基因在LSS(+/-)小鼠腦中高表達(dá)選取8周齡WT C57BL/6小鼠及LSS敲除(+/-)小鼠各3只，分別提取小鼠全腦組織總蛋白，CCKBR基因在LSS(+/-)小鼠中明顯高表達(dá)，見圖6。總ERK無(wú)變化，p-ERK在LSS(+/-)組表達(dá)較高，總AKT在LSS(+/-)組表達(dá)較低。

圖6 小鼠全腦組織Western blot分析結(jié)果

3 討論

膽固醇代謝對(duì)大腦功能影響十分重要，膽固醇合成的LSS，其催化環(huán)氧鯊烯環(huán)化成第1個(gè)固醇類化合物——羊毛固醇，因此，LSS是膽固醇合成過(guò)程中的關(guān)鍵酶之一[5]。通過(guò)RNA-Seq分析LSS敲除(+/-)小鼠及WT C57BL/6小鼠差異表達(dá)基因提示：LSS雜合敲除，導(dǎo)致了小鼠大腦中320個(gè)基因表達(dá)發(fā)生改變，其中上調(diào)基因 145個(gè)，下調(diào)175個(gè)，這些差異基因涉及了神經(jīng)活化的受體與配體通路、河馬信號(hào)通路及谷氨酸能突觸相關(guān)通路，提示LSS雜合敲除可能影響小鼠大腦功能及行為。

膽固醇對(duì)腦功能的影響至今在動(dòng)物模型及人類臨床研究中沒(méi)有取得一致的結(jié)果，有研究[6]提示高膽固醇飲食損害動(dòng)物及人的學(xué)習(xí)記憶能力，而有研究[7]卻取得了相反的結(jié)果。由于血腦屏障的關(guān)系，血液中的膽固醇并不能進(jìn)入大腦，大腦中的膽固醇主要由腦星型膠質(zhì)細(xì)胞合成[8-9]。本研究建立的LSS雜合敲除小鼠模型，理論上會(huì)導(dǎo)致大腦膽固醇合成的減少，有助于探討膽固醇對(duì)大腦功能的影響，但LSS雜合敲除理論上還導(dǎo)致了羊毛固醇及其下游產(chǎn)物的減少，而這些中間產(chǎn)物對(duì)大腦的功能也有一定影響，因此，LSS雜合敲除對(duì)腦功能的影響可能不僅僅能用膽固醇的減少來(lái)解釋，這是本模型在研究膽固醇對(duì)大腦功能影響的不足之處。 研究[10-11]表明人類LSS基因突變導(dǎo)致白內(nèi)障、少毛癥等疾病，通常伴有智力障礙，提示LSS基因突變影響大腦功能。本研究發(fā)現(xiàn)LSS雜合敲除導(dǎo)致了大腦中320個(gè)表達(dá)差異基因，這些基因與大腦的神經(jīng)信號(hào)通路有關(guān)。熒光定量PCR驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)與情緒有關(guān)基因表達(dá)顯著升高。其中CCKBR表達(dá)顯著上調(diào)，該受體活化參與調(diào)節(jié)多種神經(jīng)生物學(xué)過(guò)程，包括：焦慮、痛覺(jué)、突觸傳遞等活動(dòng)[12]，同時(shí)全腦中AKT與ERK活化成相反趨勢(shì)，研究表明ERK 活化促進(jìn)神經(jīng)元的分化，而AKT活化誘導(dǎo)神經(jīng)元祖細(xì)胞增長(zhǎng)和存活，提示這兩條信號(hào)途徑對(duì)神經(jīng)細(xì)胞生理功能均具有重要作用[13]，但CCKBR上調(diào)與AKT及ERK信號(hào)通路的關(guān)系等分子機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

本研究?jī)H分析了LSS雜合敲除導(dǎo)致小鼠大腦差異表達(dá)基因及其通路分析，給出了LSS基因功能異常及膽固醇水平變化可能影響大腦功能的分子水平的初步證據(jù)，下一步需要重點(diǎn)探討其中一些重要的基因?qū)π∈笮袨閷W(xué)的影響，并闡明LSS雜合敲除及膽固醇水平變化對(duì)大腦功能影響的分子機(jī)制，為人類疾病如阿爾茨海默病等發(fā)病機(jī)制的研究提供幫助。