基于16S rDNA測序技術分析利福平致大鼠肝損傷中腸道菌群變化特征

楊璐銘，郝金奇,2，王 林，裴盛斐，郭 玉，唐琴艷，李 玥，高學磊，李玉紅,4，郝明媛，馮福民,

利福平(rifampicin,RFP)是WHO推薦使用的一線抗結核藥物之一，然而經RFP治療的結核病患者會出現血清轉氨酶升高、輕度肝炎、肝臟膽汁淤積等肝損傷表現[1]。這種抗結核藥物性肝損傷(anti-tuberculosis drug-induced liver injury，ADLI)已成為結核病治療中的一大難題，腸道微生物組學研究的進展為ADLI的預防和治療提供了新思路。

人類腸道微生物群由1 000多種細菌組成[2]。腸道菌群處于生態平衡狀態時可以抵抗致病菌并且防止致病菌過度繁殖，但當大量使用抗生素或抗菌藥物后，腸道菌群的生態平衡被破壞，進而通過腸-肝軸調控肝臟疾病的進展[3]。此外，腸道菌群也可通過分泌對甲酚來降低對乙酰氨基酚的磺化作用，進而導致藥物性肝損傷的發生[4]。而RFP治療后的腸道菌群變化特征與ADLI的發生是否有關聯仍需研究。該研究使用16S rDNA測序技術分析RFP致ADLI大鼠模型中腸道菌群的變化特征。

1 材料與方法

1.1 實驗動物SPF級雄性SD大鼠24只，6～8周齡、體質量180～250 g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，飼養于華北理工大學實驗動物中心，大鼠自由進食與飲水，交替照明各12 h，溫度24 ℃左右，相對濕度60%～80%。本研究已獲華北理工大學動物倫理委員會審查批準(批文號：LX2018137)。

1.2 主要試劑RFP購自日本TCI公司，丙氨酸氨基轉移酶(alanine aminotransferase，ALT)、天冬氨酸氨基轉移酶(aspartate aminotransferase，AST)檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所。

1.3 RFP灌胃液配制稱取RFP粉末1.2 g溶解于60 ml生理鹽水中，配置成濃度為20 mg/ml的RFP灌胃液。

1.4 動物分組24只SD雄性大鼠經適應性喂養1周，隨機分為對照組(D0組，n=8)、RFP灌胃10 d組(R10組，n=8)、RFP灌胃28 d組(R28組，n=8)。對照組大鼠在0 d處死，其余兩組給予100 mg/(kg·d) RFP灌胃，分別于連續灌胃10 d和28 d后處死各組所有大鼠。

1.5 標本采集末次給藥24 h后，收集大鼠新鮮糞便顆粒于5 ml無菌凍存管中，置于-80 ℃保存。處死大鼠，取肝組織，經HE染色后觀察組織形態。

1.6 ALT、AST檢測按照試劑盒說明書進行操作，在96孔板中加入ALT、AST基液和血清，37 ℃孵育30 min，各孔中加入2,4-二硝基肼，37 ℃孵育20 min，各孔加入NaOH，室溫靜置。使用酶標儀檢測吸光度(optical density,OD)值。

1.7 16S rDNA測序使用隨機數字表法每組選取4只大鼠的糞便標本送至上海美吉生物醫藥科技有限公司進行16S rDNA測序。設計16S rDNA V3～V4區域的引物，引物序列為F：5′-NNNNCCTA-CGGGNGGCWGCAG-3′、R：5′-NNNNGGACTACHVG-GGTATCTAATCC-3′，擴增16S rDNA片段，將獲得PCR產物進行純化后，采用Qubit 2.0測定純化后的PCR擴增子濃度，構建cDNA文庫，使用IlluminaMiSeq平臺來測序。

1.8 腸道菌群測序結果分析Alpha多樣性分析采用Sobs指數和Shannon指數；β多樣性分析采用主坐標分析(principalco-ordinatesanalysis,PCoA)，并使用相似性分析(analysisofsimilarities,Anosim)來評估組間差異；分別從門和屬水平比較各組大鼠腸道菌群組成。

1.9 統計學處理使用STAMP和R軟件進行組間差異分析。STAMP軟件中的ANOVA檢驗和Rstats包中的Kruskal-Wallis秩和檢驗用于多組間差異分析，Wilcoxon秩和檢驗用于兩組間差異分析。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 實驗大鼠肝組織HE染色結果D0組肝小葉結構正常，肝細胞形態完整，整齊排列，細胞核大小正常；R10組肝細胞排列紊亂、細胞質疏松，伴有氣球樣變和點狀壞死；R28組可見肝小葉結構破壞，大面積肝細胞溶解性壞死且部分細胞核染色變深。見圖1。與R0組比較，R10組和R28組ALT、AST水平升高(P<0.05)，差異有統計學意義，見表1。表明隨著RFP灌胃時間的延長，肝細胞出現損傷現象，大鼠ADLI造模成功。

表1 三組大鼠血清ALT、AST水平變化

圖1 三組大鼠肝組織病理學光鏡圖 ×200

2.2 實驗大鼠腸道菌群結構的變化Sobs指數和Shannon指數可以反映群落物種數量和群落多樣性，D0組、R10組、R28組Sobs指數差異有統計學意義(P<0.05)，Shannon指數差異無統計學意義(P>0.05)，見圖2。通過PCoA圖對腸道菌群進行β多樣性分析，可以直觀的看到D0組、R10組、R28組明顯分開，而各組組內樣本呈現聚集現象，第一主成分(PC1)和第二主成分(PC2)分別解釋了總變量的33.93%和23.35%；結合Anosim分析，三組大鼠組內腸道菌群結構相似，各組間腸道菌群結構差異有統計學意義(P<0.01)，見圖3。說明在RFP致大鼠肝損傷過程中改變了腸道菌群結構及其豐富度，而多樣性未發生改變。

圖2 三組大鼠腸道菌群的Alpha多樣性

圖3 三組大鼠腸道菌群的PCoA圖

2.3 實驗大鼠腸道菌群物種組成分析根據OUT物種注釋結果，三組大鼠在門水平上主要由厚壁菌門(Firmicutes)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、放線菌門(Actinobacteria)、疣微菌門(Verrucomicrobia)和Proteobacteria構成，其中Firmicutes和Bacteroidetes占細菌總數的85%以上，在三組中均豐度最高。Kruskal-Wallis檢驗結果顯示，在三組中豐度變化有差異的是Firmicutes、Bacteroidetes、Actinobacteria和Verrucomicrobia。與D0組大鼠比較，隨著給予RFP藥物時間的延長，Bacteroidetes豐度增加，Firmicutes豐度減少，Actinobacteria豐度先增加后減少，Verrucomicrobia豐度先減少后增加(P<0.05)。其中Firmicutes、Bacteroidetes、Actinobacteria豐度變化較明顯，D0組、R10組、R28組Firmicutes豐度分別為72%、53%、32%；Bacteroidetes豐度分別為17%、33%、61%；Actinobacteria豐度分別為4%、16%、2%。進一步兩兩比較，與D0組比較，R10組Firmicutes和Patescibacteria豐度減少，R28組Firmicutes和Actinobacteria豐度減少，Bacteroidetes豐度增加(P<0.05)；與R10組比較，R28組Actinobacteria豐度減少(P<0.05)。見圖4。

圖4 三組大鼠腸道菌群在門水平的組成及差異分析

在屬水平上，三組大鼠糞便樣本中共有Lactobaclllus、Bifidobacterium、Romboutsia等21個屬，Kruskal-Wallis檢驗結果顯示，三組大鼠腸道菌群相對豐度有統計學差異的屬共15個。與D0組比較，隨著給予RFP藥物時間的延長unclassified_f_Prevotellaceae、Blautia、Prevotellaceae_NK3B31_group、Erysipelotrichaceae_uCG-003、Fournierella豐度增加，Lactobacillus、Romboutsia、Ruminococcaceae_uCG-014豐度減少，Bifidobacterium、Dubosiella、Faecalibaculum豐度先增加后減少，Alloprevotella、Akkermansia、Prevotellaceae_Ga6A1_group、Ruminococcus_1豐度先減少后增加(均P<0.05)，其中Lactobacillus豐度變化較為明顯，D0組、R10組、R28組Lactobacillus豐度分別為52%、34%、8%；與D0組比較，R10組Dubosiella、unclassified_f_lachnospiraceae、Faecalibaculum豐度增加，R28組norank_f_Muribaculaceae、Ruminococcus_1豐度增加，Lactobacillus豐度減少；與R10組比較，R28組Lactobacillus、Faecalibaculum豐度減少，Ruminococcus_1豐度增加(P<0.05)。見圖5。

圖5 三組大鼠腸道菌群在屬水平的組成及差異分析

3 討論

腸道菌群是衡量機體健康程度及水平的指標之一，已有研究發現腸道菌群多樣性與多種疾病有關。本研究選擇16S rDNA高通量測序技術對RFP誘導大鼠肝損傷模型中的腸道菌群多樣性進行分析，其結果能夠有效解釋糞便標本中腸道菌群的物種分布、豐度、差異以及進化關系，為RFP誘導的ADLI機制研究提供了新的視角，為ADLI的預防及治療提供實驗理論基礎。

腸道是微生物群的天然棲息地，菌群可以通過各種途徑發揮作用。有益菌群，比如糞球菌屬(Coprococcus)、假丁酸弧菌屬(Pseudobutyrivibrio)、羅氏菌屬(Rothia)等，可以通過產生短鏈脂肪酸而使宿主受益[5]。在本研究中，厚壁菌門(Firmicutes)和擬桿菌門(Bacteroidetes)在RFP構建的大鼠ADLI模型中是絕對優勢菌群，隨著給予RFP藥物時間的延長，Bacteroidetes豐度增加，Firmicutes豐度減少，雖然影響了其組成比例，但未影響優勢菌群的種類。Firmicutes和Bacteroidetes在不同的肝臟疾病均被證實可以影響疾病的進展，比如，Bacteroidetes減少，放線菌門(Actinobacteria)的增加，會導致肝病的惡化[6]。也有研究發現，在酒精性肝病發生后，起到抗炎和保護黏膜作用的Firmicutes呈現顯著降低[7]。大鼠給予RFP灌胃后，Bacteroidetes豐度增加，說明Bacteroidetes參與了ADLI發生，但因果關系尚不明確。

同樣的，有研究報道指出腸道微生物群對藥物的代謝有直接和間接的影響[8]，這導致腸道菌群中有益菌群和致病菌群豐度變化程度不同，這可能是Actinobacteria豐度先增加后減少的原因，進一步的，在屬水平上，本研究發現在ADLI大鼠腸道中Lactobacillus數量減少，Lactobacillus作為一種有益共生菌屬，可增強小鼠肝臟的核轉錄因子E2相關因子2活性，進而起到保護肝臟免受氧化性損傷[9]。在慢性肝炎患者和全身炎癥反應綜合征患者糞便中均表現出致病菌數量增加，Bifidobacterium和Lactobacillus等有益菌的數量減少[10-11]，與本研究結果一致。

本研究通過對大鼠腸道菌群的分析，證實了RFP致ADLI的發生改變了大鼠腸道菌群的豐度，未改變其多樣性，菌群的結構和組成均發生了改變，有益菌減少，致病菌增多。本研究對大鼠的飼養過程進行了嚴格的質量控制，提升了腸道菌群與ADLI之間聯系的可靠性，然而大鼠的飼養時間也可能是一個影響因素，未能在每個時間點設置空白對照組是本研究的局限性。腸道菌群數量較多，組成復雜，探究關鍵菌群在ADLI中如何發揮作用仍是進一步研究的重點。