YAP在非賁門胃癌的表達(dá)及其基因多態(tài)性與YAP表達(dá)水平的關(guān)系

馬立聰，田旭陽，劉得利，白雪峰，賈彥彬2,,5

胃癌是常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率和死亡率均位居所有惡性腫瘤的前列[1]。我國是胃癌的高發(fā)地區(qū)，據(jù)統(tǒng)計，2018年我國新增胃癌病例45.6萬例，因胃癌死亡病例39萬例[2]，嚴(yán)重影響人民的生命健康。Yes相關(guān)蛋白(Yes-associated protein,YAP)是Hippo腫瘤抑制通路中的主要效應(yīng)因子[3]，去磷酸化的YAP能夠在細(xì)胞核中作為轉(zhuǎn)錄共調(diào)節(jié)因子誘導(dǎo)一些基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，調(diào)控細(xì)胞的增殖、凋亡、分化，進(jìn)而調(diào)控組織穩(wěn)定和器官生長[4]。目前，國內(nèi)外有關(guān)YAP基因單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphisms,SNP)與其蛋白表達(dá)水平的關(guān)系未見報道。該研究采用免疫組織化學(xué)SP法檢測YAP蛋白在非賁門胃癌組織和癌旁正常胃組織中的表達(dá)差異，分析YAP蛋白表達(dá)水平與臨床病理特征的關(guān)系，并首次研究了YAP基因SNP與其蛋白表達(dá)水平之間的關(guān)系，初步探討YAP與非賁門胃癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)系，為胃癌的防治提供新思路。

1 材料與方法

1.1 研究對象病例組為2008—2011年包頭市腫瘤醫(yī)院經(jīng)病理學(xué)確診的非賁門胃癌病例126例，所有病例均為漢族，且三代無與其他民族通婚史，發(fā)病時已在包頭市居住5年以上的原發(fā)病例，且未接受過化療和放療。其中104例為手術(shù)根治標(biāo)本，同時留取了距腫物≥5 cm的正常胃組織。其余22例為胃鏡下咬鉗組織，無正常對照。所有癌組織和正常胃組織均經(jīng)高年資病理醫(yī)師在顯微鏡下確認(rèn)。所有病例均留取2 ml外周血，并提供知情同意書，本課題已獲包頭醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 YAP蛋白表達(dá)水平檢測采用免疫組織化學(xué)SP法檢測126例非賁門胃癌組織和104例癌旁正常組織中YAP蛋白的表達(dá)水平。SP試劑盒購自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司，YAP一抗購自艾博抗(上海)貿(mào)易有限公司。將非賁門胃癌組織及癌旁正常組織進(jìn)行石蠟切片，切片厚3 μm，烤片2 h，然后依次用二甲苯脫蠟，梯度乙醇脫二甲苯，水洗，檸檬酸高溫高壓修復(fù)，PBS緩沖液洗脫，一抗4 ℃孵育過夜，PSB緩沖液洗脫，二抗孵育0.5 h，DAB顯色，顯微鏡下觀察染色結(jié)果。所有免疫組化染色結(jié)果均由2位高年資病理醫(yī)師采用雙盲法判定，每張切片隨機(jī)選取5個視野，以胞核和胞質(zhì)中出現(xiàn)背景清晰的棕黃色顆粒作為陽性結(jié)果，由陽性細(xì)胞百分比和陽性強度共同決定其表達(dá)水平。陽性細(xì)胞百分比：≤5%為0分，>5%～25%為1分，>25%～50%為2分，>50%～75%為3分，>75%為4分；陽性強度：陰性為0分，弱陽性為1分，中度陽性為2分，強陽性為3分。陽性細(xì)胞百分比與陽性強度評分乘積≥1分則認(rèn)為YAP呈陽性表達(dá)。

1.3 SNP的篩選根據(jù)Hapmap數(shù)據(jù)庫(http://hapmap.ncbi.nlm.nih.gov/)提供的中國漢族人群多態(tài)性數(shù)據(jù)，在YAP基因進(jìn)行了標(biāo)記單核苷酸多態(tài)性(Tag-SNP)的篩選，要求最小等位基因頻率(minimum allele frequency，MAF)>0.05，連鎖不平衡相關(guān)系數(shù)(r2)>0.8。根據(jù)文獻(xiàn)報道的可能與疾病相關(guān)的SNP[5-6]，優(yōu)先選擇了rs11225163和rs1820453兩個多態(tài)性位點進(jìn)行分析。

1.4 SNP的分型采用外周血DNA提取試劑盒提取126例樣本外周血白細(xì)胞DNA，試劑盒購自北京天根生化科技(北京)有限公司。采用Taqman探針法對126例樣本進(jìn)行基因分型，基因分型在北京賽默百合生物科技有限公司完成。實驗中設(shè)陰性對照和陽性對照，基因分型沒有成功的樣本不再進(jìn)行重復(fù)實驗。實驗中隨機(jī)選取5%DNA質(zhì)量和數(shù)量較好的樣本進(jìn)行重復(fù)實驗，以驗證結(jié)果的準(zhǔn)確性。經(jīng)檢測，所有重復(fù)樣本基因分型結(jié)果的一致性為100%。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理采用R軟件(version3.5.0;http://www.r-project.org)進(jìn)行統(tǒng)計分析，采用χ2檢驗或Fisher確切概率法分析病例組和對照組中YAP蛋白表達(dá)水平的差異以及YAP蛋白表達(dá)水平與年齡、性別、腫瘤分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況以及腫瘤大小等臨床病理特征之間的關(guān)系，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。采用非條件性Logistic回歸法計算經(jīng)年齡、性別調(diào)整后的比值比(odds ration，OR)值以及95%置信區(qū)間(confidence intervals,CI)，用以評估兩個SNP在共顯性、顯性、超顯性、隱性和附加5種遺傳模式下與YAP蛋白表達(dá)水平之間的關(guān)聯(lián)性，采用Haploview 4.2軟件構(gòu)建單體型，并分析單體型與YAP蛋白表達(dá)水平的關(guān)聯(lián)性。

2 結(jié)果

2.1 YAP蛋白在126例非賁門胃癌組織和104例癌旁正常組織中的表達(dá)情況在126例非賁門胃癌組織中，YAP蛋白表達(dá)陰性者16例(12.7%)，陽性者110例(87.3%)，其中，評分1分者37例，2分者40例，3分者33例。在104例癌旁正常組織中，YAP蛋白表達(dá)陰性者57例(54.8%)，陽性者47例(45.2%)，其中，評分1分者35例，2分者11例，3分者1例。統(tǒng)計分析得出，YAP蛋白在非賁門胃癌組織中的表達(dá)水平高于其在癌旁正常組織中的表達(dá)水平，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=46.630，P<0.001)，見圖1。

圖1 YAP蛋白在非賁門胃癌組織及癌旁正常組織中的表達(dá)情況 ×100

2.2 YAP蛋白表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系YAP蛋白表達(dá)水平與腫瘤分化程度呈負(fù)相關(guān)(P<0.05)，與性別、年齡、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及腫瘤大小無關(guān)聯(lián)(P>0.05)，見表1。

2.3YAP基因多態(tài)性與其蛋白表達(dá)水平的關(guān)聯(lián)性統(tǒng)計結(jié)果顯示，SNP rs11225163和rs1820453在共顯性、顯性、超顯性、隱性和附加5種遺傳模式下與YAP蛋白表達(dá)水平之間無關(guān)聯(lián)，見表2。

表2 5種遺傳模型下SNP rs11225163、rs1820453與YAP蛋白表達(dá)的關(guān)聯(lián)性

2.4YAP單體型與蛋白表達(dá)水平的關(guān)聯(lián)性使用Haploview 4.2軟件對所研究的SNP進(jìn)行連鎖不平衡檢驗，計算LOD值、連鎖不平衡系數(shù)D′，采用D′置信區(qū)間法構(gòu)建單體型。結(jié)果顯示，所研究的YAP基因2個SNP位點之間未構(gòu)成單體型塊。

3 討論

YAP是Hippo腫瘤抑制通路中的核心組件，被證實在肺癌、乳腺癌、大腸癌等多種惡性腫瘤中的表達(dá)水平顯著升高[7-9]。此外，韓新影 等[10]發(fā)現(xiàn)，YAP蛋白在胃癌組織中的表達(dá)水平顯著高于癌旁組織(P<0.05)。Yan et al[11]同樣在其研究中發(fā)現(xiàn)，YAP蛋白在人胃癌細(xì)胞系A(chǔ)GS中的表達(dá)水平顯著高于正常胃黏膜細(xì)胞，提示YAP可能參與了胃癌的發(fā)展。但所有相關(guān)研究均未對胃癌的組織學(xué)類型進(jìn)行分類，這可能對研究結(jié)果造成偏倚。胃癌分為賁門癌和非賁門癌兩類，賁門癌在流行病學(xué)、臨床病理特征及分子生物學(xué)特征等方面與食管癌相近，因此，為了保持研究樣本的均質(zhì)性，本研究將病例限定為非賁門胃癌。

本研究結(jié)果顯示，YAP蛋白在非賁門癌組織中的表達(dá)水平較正常胃組織顯著升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)，與上述學(xué)者相關(guān)研究結(jié)果相符，說明YAP可能參與了非賁門胃癌的發(fā)病過程。Han et al[12]在其研究中發(fā)現(xiàn)，YAP蛋白在胃癌組織中的表達(dá)水平顯著高于癌旁正常胃組織，并且與年齡、腫瘤分化程度、浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TNM分期等臨床病理特征呈正相關(guān)。本研究同樣分析了YAP蛋白表達(dá)水平與臨床病理特征之間的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)其表達(dá)水平與腫瘤分化程度呈正相關(guān)(P<0.05)，與Han et al[12]的研究結(jié)果一致。這一結(jié)果剛好證實了YAP具有調(diào)節(jié)細(xì)胞分化程度的生物學(xué)功能[13-14]，腫瘤細(xì)胞分化程度越低提示患者預(yù)后越差，換言之，可以推測YAP在非賁門胃癌組織中的表達(dá)水平越高，患者的預(yù)后越差，YAP蛋白表達(dá)水平或許可能成為判斷非賁門胃癌患者預(yù)后的指標(biāo)。

本研究并未發(fā)現(xiàn)YAP蛋白表達(dá)與性別、年齡、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和腫瘤大小存在關(guān)聯(lián)，與Han et al[12]的研究結(jié)果不符，出現(xiàn)這一結(jié)果的原因可能有：第一，本研究將胃癌類型限定為非賁門胃癌，而Han et al[12]的研究并未區(qū)分賁門癌與非賁門癌，YAP蛋白在非賁門胃癌組織中的表達(dá)水平可能不受性別、年齡、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和腫瘤大小等因素的影響；第二，可能與本研究納入的樣本量較小有關(guān)，因此本研究結(jié)果還需進(jìn)一步證實。

YAP蛋白由YAP基因所編碼，該基因位于人類常染色體11q22.1[15]。本研究選擇了YAP基因中rs11225163和rs1820453這兩個SNP進(jìn)行研究，其中rs11225163位于內(nèi)含子區(qū)域，被發(fā)現(xiàn)與黑色素瘤患者的存活率相關(guān)[5]，與攜帶CT+TT基因型比較，攜帶CC基因型患者存活率降低[CCvs.CT+TT:HR=1.79,95%CI=1.18～2.72,P=0.007]。rs1820453位于可變區(qū)上游2 kb，Chen et al[6]的研究發(fā)現(xiàn)，rs1820453與中國婦女乳腺癌的發(fā)病相關(guān)，與攜帶AA基因型的人比較，攜帶CC基因型的人患乳腺癌的風(fēng)險顯著增加(OR=2.05，95%CI=1.19～3.53，P= 0.009)。上述研究并未探討疾病的發(fā)生是否是由于兩個SNP引起蛋白表達(dá)的改變從而致病，或研究的SNP是否與其他已知致病SNP之間存在強連鎖不平衡而與疾病的發(fā)生發(fā)展關(guān)聯(lián)。