脂聯素參與七氟醚預處理保護心肌缺血再灌注損傷后小鼠認知功能的機制研究*

王春暉，岳毅，劉少凱，劉小霞，柳元楨，張彥清

（1.山西醫科大學麻醉學院，山西太原 030001；2.武警山西總隊醫院神經外科，山西太原 030006；3.山西醫科大學附屬第一醫院麻醉科，山西太原 030001）

術后認知功能障礙（postoperative cognitive dysfunction, POCD）是指患者手術麻醉后出現思維、行為、學習、記憶和注意力等認知和腦功能的改變[1-2]。在體外循環下的心臟手術中，心肌缺血再灌注（myocardial ischemia reperfusion, MIR）是不可或缺的環節。POCD 已經成為此類手術最常見的并發癥[3]。如何最大限度減輕MIR 相關的POCD 和腦功能損傷是目前心腦血管領域亟須解決的重大問題和臨床需求。

有研究表明[4-5]，以七氟醚為代表的揮發性麻醉藥物預處理可以減輕MIR 引起的POCD，然而其機制尚未完全明確。脂聯素是一種主要由脂肪細胞分泌的細胞因子，其在一定程度上延緩了POCD 的發生發展[6-7]，但尚不清楚七氟醚預處理的保護機制是否與脂聯素的上調有關。

本研究使用野生健康成年SPF 級雄性C57BL/6小鼠和健康成年SPF 級雄性脂聯素基因敲除（adiponectin knock-out, APN KO）小鼠，復制MIR 模型，擬從多角度闡述脂聯素在七氟醚預處理保護MIR 模型小鼠認知功能中的作用。

1 材料與方法

1.1 動物、試劑及儀器

野生健康成年SPF 級雄性C57BL/6 小鼠30 只，鼠齡8～10 周，體重20～25 g，購自山西醫科大學動物實驗中心[動物實驗生產許可證號：SCXK（晉）2015-0001]；健康成年SPF 雄性APN KO 小鼠40 只，鼠齡8～10 周，體重20～25 g，由上海南方模式生物科技有限公司提供[動物實驗生產許可證號：SCXK（晉）2015-0001]。七氟醚（上海恒瑞醫藥有限公司，國字準藥H20070172，規格：100 mL），小鼠脂聯素酶聯免疫雙抗夾心法試劑盒（美國博士德生物工程有限公司，EK0596），脂聯素替代劑（AdipoRon）（美國Med Chem Express 公司），2%七氟烷（上海恒瑞醫藥有限公司，批號：19101331）。小動物呼吸機（美國Harvard 公司）。

1.2 動物分組與模型復制

C57BL/6 小鼠隨機分為sham 組、MIR-Control 組及MIR-SevoPre 組，每組10 只。APN KO 小鼠隨機分為KO-sham 組、KO-MIR-Control 組、KO-MIR-Sevopre組及KO-MIR-Sevopre-AdipoRon 組，每組10 只。MIR-Control 組、MIR-SevoPre 組、KO-MIR-Control、KO-MIR-Sevopre 組、KO-MIR-Sevopre-AdipoRon 組采用結扎冠狀動脈左前降支30 min 恢復灌注的方法復制MIR 模型；sham 組和KO-sham 組只穿線不結扎； MIR-SevoPre 組、KO-MIR-Sevopre 組和KOMIR-Sevopre-AdipoRon 組小鼠置于麻醉罐中，通入2%七氟烷10 min 后通入95%O2-5%CO2，循環3 次，每次間隔15 min。KO-MIR-Sevopre-AdipoRon 組：模型復制前10 min，七氟醚預處理的APN KO 小鼠口服溶于玉米油的AdipoRon 20 mg/kg。

1.3 Morris水迷宮實驗

3 組C57BL/6 小鼠及4 組APN KO 小鼠均在模型復制或對照處理后第1 天、第2 天、第4 天進行Morris 水迷宮實驗。參照BARNHART 等的方法[9]，每次將小鼠分別從1、2、4 象限中點放入水池，記錄小鼠的游泳速率和找到平臺時間，即潛伏期，假如小鼠在1 min內還沒找到平臺，引導小鼠到平臺上停留20 s，潛伏期按1 min 計。

1.4 血漿脂聯素水平

采集3 組C57BL/6 小鼠在模型復制或對照處理后24 h 的頸總動脈血2.5 mL，4℃、3 000 r/min 離心10 min，取上清液，嚴格按照小鼠脂聯素酶聯免疫雙抗夾心法試劑盒說明書測定脂聯素水平。使用三分位數作為節點，將脂聯素水平分為高分子量、中分子量、低分子量3 種，比較3 組C57BL/6 小鼠的總脂聯素、高分子量脂聯素、中分子量脂聯素、低分子量脂聯素水平。

1.5 統計學方法

采用Excel 2010 建立數據庫，采用SPSS 26.0 統計軟件進行數據分析。計量資料用均數±標準差（±s）表示，比較采用重復測量設計的方差分析或方差分析，進一步兩兩比較用LSD-t檢驗；采用Pearson 法檢驗相關性。P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 3組C57BL/6小鼠模型復制后第1天、第2天和第4天的游泳速率比較

3 組C57BL/6 小鼠模型復制后第1 天、第2 天和第4 天的游泳速率比較，采用重復測量設計的方差分析，結果：①不同時間點的小鼠游泳速率無差異（F=0.543，P=0.584）；②3 組小鼠游泳速率無差異（F=52.907，P=0.375）；③3 組小鼠游泳速率的變化趨勢無差異（F=1.266，P=0.295）。見表1。

表1 3組C57BL/6小鼠模型復制后第1天、第2天和第4天的游泳速率比較 （n=10，cm/s，±s）

表1 3組C57BL/6小鼠模型復制后第1天、第2天和第4天的游泳速率比較 （n=10，cm/s，±s）

組別sham組MIR-Control組MIR-Sevopre組第1天17.72±0.61 17.62±0.43 17.11±0.68第2天17.43±0.48 17.45±0.50 17.32±0.79第4天17.47±0.39 17.76±0.55 17.33±0.53

2.2 3組C57BL/6小鼠模型復制后第1天、第2天和第4天的潛伏期比較

3 組C57BL/6 小鼠模型復制后第1 天、第2 天和第4 天的潛伏期比較，采用重復測量設計的方差分析，結果：①不同時間點的小鼠潛伏期有差異（F=1662.005，P=0.000）；②3 組小鼠的潛伏期有差異（F=38.685，P=0.000），與sham 組比較，MIR-Control 組各時間點潛伏期延長（P＜0.05），與MIR-Control 組比較，MIR-Sevopre 組小鼠各時間點潛伏期縮短（P＜0.05）；③3 組小鼠的潛伏期變化趨勢有差異（F=5.870，P=0.002）。見表2。

表2 3組C57BL/6小鼠模型復制后第1天、第2天和第4天的潛伏期比較 （n=10，s，±s）

表2 3組C57BL/6小鼠模型復制后第1天、第2天和第4天的潛伏期比較 （n=10，s，±s）

注：①與sham 組比較，P ＜0.05；②與MIR-Control 組比較，P ＜0.05。

第4天10.29±0.97 15.57±1.27①10.22±1.28②組別sham組MIR-Control組MIR-Sevopre組第1天34.09±1.35 35.41±3.20①34.30±1.63②第2天26.73±0.98 30.06±1.23①27.26±1.09②

2.3 3組C57BL/6小鼠的脂聯素水平比較

3 組C57BL/6 小鼠的脂聯素水平比較，采用方差分析，總脂聯素、高分子量脂聯素、中分子量脂聯素差異有統計學意義（P＜0.05），低分子量脂聯素差異無統計學意義（P＞0.05）；進一步兩兩比較，與sham 組相比，MIR-Control 組血漿總脂聯素、高分子量脂聯素、中分子量脂聯素水平降低（P＜0.05），與MIR-Control 組相比，MIR-Sevopre 組血漿總脂聯素、高分子量脂聯素、中分子量脂聯素水平升高（P＜0.05）。見表3。

表3 3組C57BL/6小鼠的脂聯素水平比較（n=10，μg/mL，±s）

表3 3組C57BL/6小鼠的脂聯素水平比較（n=10，μg/mL，±s）

注：①與sham 組比較，P ＜0.05；②與MIR-Control 組比較，P ＜0.05。

分組總脂聯素sham組MIRControl組MIRSevopre組F 值P 值8.98±0.16 4.99±0.14①高分子脂聯素3.59±0.24 1.98±0.13①中分子脂聯素1.98±0.11 1.48±0.11①低分子脂聯素1.48±0.09 1.48±0.10 7.76±0.16②2.53±0.15②1.67±0.11②1.45±0.09 0.688 0.511 170.261 0.000 6.461 0.000 16.978 0.000

2.4 3 組C57BL/6 小鼠認知功能與脂聯素水平的相關性

Sham 組小鼠的潛伏期與脂聯素水平呈負相關（r=-0.480，P=0.033），MIR-Control 組小鼠的潛伏期與脂聯素水平呈負相關（r=-0.300，P=0.040），MIR-Sevopre 組小鼠的潛伏期與脂聯素水平呈負相關（r=-0.730，P=0.019）。

2.5 4組APN KO小鼠模型復制后第1天、第2天和第4天的潛伏期比較

4 組APN KO 小鼠模型復制后第1 天、第2 天和第4 天的潛伏期比較，采用重復測量設計的方差分析，結果：①不同時間點小鼠潛伏期有差異（F=1428.137，P=0.000）；②4 組小鼠的潛伏期有差異（F=34.611，P=0.000），與KO-sham 組比較，KOMIR-Control 組潛伏期延長（P＜0.05）；與KO-MIRControl 組相比，KO-MIR-Sevopre 組潛伏期無差異（P＞0.05）；與KO-MIR-Sevopre 組比較，KO-MIRSevopre-AdipoRon 組潛伏期縮短（P＜0.05）；③4 組小鼠潛伏期的變化趨勢無差異（F=2.054，P=0.069）。見表4。

表4 4組APN KO小鼠模型復制后第1天、第2天和第4天的潛伏期比較 （n=10，s，±s）

表4 4組APN KO小鼠模型復制后第1天、第2天和第4天的潛伏期比較 （n=10，s，±s）

注：①與KO-sham 組比較，P ＜0.05；②與KO-MIR-Sevopre 組比較，P ＜0.05。

?組別KO-sham組KO-MIR-Control組KO-MIR-Sevopre組KO-MIR-Sevopre-AdipoRon組第1天35.90±3.73 41.90±2.13①37.50±1.58 36.90±2.02②第2天31.90±1.91 37.60±1.51①34.00±2.45 32.30±2.31②第4天11.30±1.49 16.30±2.21①15.00±1.70 14.20±1.75②

3 討論

脂聯素是脂肪細胞分泌的一種多功能蛋白[10]，對認知相關疾病具有保護作用[11]，本團隊前期實驗結果表明脂聯素參與了七氟醚預先給藥改善MIR 小鼠的認知功能的過程[12]，但是這種作用是否與血漿脂聯素水平升高有關，兩者之間是否具有劑量依賴性仍未可知。

MIR 是臨床常見的病理生理現象，心臟血液的再灌注會引起機體體內生理環境失衡，并對心[13]、腦[4]等多個臟器產生影響[14]，本研究結果同樣證明在MIR 后24 h MIR-Control 組和KO-MIR-Control 組的水迷宮潛伏期延長，認知功能受損。同時本研究結果顯示模型復制后各組小鼠游泳速率無明顯差異，這提示MIR 影響C57BL/6 小鼠的認知功能但并不影響小鼠的運動功能。有研究表明，七氟醚等[4，15]揮發性氣體對MIR 相關的認知障礙具有延緩作用，本研究結果同樣顯示KO-MIR-Sevopre-AdipoRon 組潛伏期縮短，認知功能改善。有研究顯示，MIR 血液中的脂聯素水平降低[16-17]，而脂聯素水平與認知功能相關[7，11]，與本研究結果一致。本研究通過對3 組C57BL/6 小鼠的脂聯素水平和認知功能進行相關性分析發現，兩者之間呈負相關。

2013年，東京大學OKADA-IWABU 教授等[18]篩選與脂聯素作用相似的小分子化合物并命名為脂聯素受體激動劑AdipoRon。AdipoRon 是否具有和脂聯素相似的認知改善作用尚未被證實。本研究結果發現與KO-MIR-Sevopre 組比較，KO-MIR-Sevopre-AdipoRon 組潛伏期縮短，而KO-MIR-Control 組與KO-MIR-Sevopre 組之間無明顯差異，提示七氟醚發揮其保護作用與脂聯素有關。

本研究仍存在一些局限性：關于小鼠認知能力的檢驗方法單一，應采取行為學量表和認知相關蛋白檢測相結合的方法，使實驗結果更全面客觀。此外，七氟醚預處理對MIR 損傷后小鼠認知功能的保護作用是否是直接作用，還是通過降低損傷間接改善認知功能仍是未知的，有待進一步研究。