可減弱豆腥味酵母菌的篩選及其在豆渣飲料中的應用

陳臣，田同輝，劉政，李立，何曉葳，于海燕，馬新新，田懷香*

（1.上海應用技術大學香料香精化妝品學部，上海 201418；2.上海清美綠色食品（集團）有限公司，上海 201314）

豆渣是豆漿或豆腐生產過程中產生的不溶性殘渣，是豆制品加工過程中常見的一種副產物。我國是世界上豆渣生產量最大的國家之一，每年豆制品加工企業（不包括榨油）能產生約2 000萬噸濕豆渣[1-2]。研究表明，豆渣中含有豐富的膳食纖維、蛋白質等營養物質，具有良好的保健功能[3]。然而，目前多數企業對豆渣的利用率極低，企業對豆渣的處理方式大多是以低價售賣給養殖戶作為飼料，或直接當作廢棄物處理[4]。造成這種現象的主要原因之一是豆渣的豆腥味嚴重，以其為原料制作的相關產品在風味方面難以被消費者接受[5]，因此，改善豆渣風味，尤其是減弱其豆腥味對其利用率的提高具有重要意義。

目前用于減弱豆渣豆腥味的方法主要有物理法、化學法、酶法和發酵法，前3種方法因存在能耗大、副反應多、試劑污染嚴重、需嚴格控制反應條件等不足而未得到廣泛應用[6-7]。發酵法主要是依靠特定微生物的產香和酶解能力產生風味良好的代謝產物來掩蓋豆腥味，或將豆腥味物質進一步分解成為其他風味組分，從而達到減弱豆腥味的效果[8]。發酵法在減弱豆渣豆腥味方面具有非常好的潛力，其效果的關鍵取決于如何針對產生豆腥味的關鍵化合物進行篩選從而獲得可降低豆腥味的微生物[9-10]。

基于此，本研究首先利用頂空固相微萃取與氣相色譜-質譜聯用技術（headspace-solid phase microextraction-gas chromatography-mass spectrometry，HS-SPMEGC-MS）分析未發酵豆渣中的風味物質，通過氣相色譜-嗅聞技術（gas chromatography-olfactometry，GC-O）結合香氣活力值（odor activity value，OAV）確定主要豆腥味風味化合物；在此基礎上，通過對不同酵母菌發酵所得的豆渣樣品進行感官評價及豆腥味風味組分分析，篩選出能利用豆渣發酵產香且可減弱豆渣豆腥味的優質菌株，并將其應用于豆渣飲料中。本試驗可為豆渣的綜合利用以及附加產品的開發提供一定的理論依據，對豆渣的綜合利用具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮豆渣樣品：上海市清美綠色食品（集團）有限公司；發酵乳制品（乳扇、乳餅）：采樣于云南大理地區，于4℃低溫采樣箱保存后運輸至上海應用技術大學樣品處理實驗室；馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）、麥芽浸粉肉湯（malt extract broth，MEB）：北京陸橋技術有限責任公司；通用引物NL1和NL4、瓊脂糖凝膠：北京康為世紀生物科技有限公司；2-辛醇（分析純）、正構烷烴 C6～C30（色譜純）：美國 Sigma-Aldrich Chemical公司；黃原膠、高酰基結冷膠（均為食品級）：美國Kelco公司；食用白砂糖、檸檬酸（均為食品級）：浙江一諾生物科技有限公司。

1.2 儀器與設備

LDZX-50KBS滅菌鍋：上海申安醫療器械廠；XSPBM-2CE生物顯微鏡：上海彼愛姆光學儀器制造有限公司；ProFlexPCR 儀：美國Applied Biosystems公司；DYCP-32A電泳儀：北京六一生物技術有限公司；THZ-98A超凈工作臺、GHP-9050隔水式電熱恒溫培養箱：上海一恒科學儀器有限公司；Agilent 7890B-5977B氣相色譜質譜聯用儀：美國安捷倫科技有限公司；ODP-3嗅聞儀：德國Gerstel科技有限公司；75 μm CAR/PDMS萃取頭：美國Supelco公司。

1.3 方法

1.3.1 豆渣中主要豆腥味化合物的確定

1.3.1.1 HS-SPME-GC-MS分析條件

采用頂空固相微萃取-氣質聯用法分析豆渣樣品中的香氣成分，分析條件參照Tian等[11]的方法并稍作修改，每個樣品均平行測定3次。

頂空固相微萃取（headspace-solid phase microextraction，HS-SPME）條件：稱取2 g新鮮豆渣樣品置于20 mL 頂空瓶中，加入 2 mL NaCl溶液（30 g/L）和 20 μL內標物2-辛醇（40 mg/L）。頂空瓶用聚四氟乙烯硅膠墊密封后置于250 r/min、60℃水浴中平衡10 min后，將提前老化好的萃取頭插入頂空瓶中萃取40 min。萃取完成后將萃取頭置于GC進樣口250℃解吸5 min，進行氣相色譜-質譜分析。萃取頭第一次老化時間為30 min，之后每次使用后老化15 min。

氣相（gas chromatography，GC）條件：HP-Innowax色譜柱（60 m×0.25 mm×0.25 μm）；載氣為氦氣，流量1 mL/min；升溫程序：初始溫度40℃保持3 min，以5℃/min速率升至120℃，保持4 min，以8℃/min速率升至200℃，保持8 min，最后以10℃/min升至230℃，保持10 min；進樣方式為不分流進樣，進樣口溫度為250℃。

質譜（mass spectrometry，MS）條件：電子轟擊離子源（electron-impact ionization，EI），電離能量為 70eV；離子源溫度230℃，接口溫度250℃，四極桿溫度150℃；掃描模式為全掃描，質量掃描范圍m/z 30～450。

定性分析：揮發性化合物的定性通過與NIST 17譜庫進行比較，保留匹配度大于80的結果。同時根據相同色譜條件下C6～C30正構烷烴的保留時間計算檢測物質的保留指數（retention index，RI），并與文獻報道的RI值進行比對。

定量分析：揮發性風味物質含量的測定采用內標法，根據化合物與內標物峰面積的比值進行計算。所用內標物為20 μL 2-辛醇（濃度為40 mg/L），根據于海燕等[12]的方法計算待測物質的濃度。

1.3.1.2 GC-O分析及OAV值測定

采用Agilent7890B氣相色譜儀，配ODP-3嗅覺檢測器端口進行嗅聞分析，色譜條件和升溫程序與1.3.1.1中GC條件一致。采用時間強度法（odor specific mag nitude estimation，OSME）進行GC-O分析。選取5名嗅覺靈敏、已受過氣味識別培訓的感官評價人員，在試驗過程中描述并記錄各氣味活性化合物的出峰時間以及香氣描述，并使用0～5的5點強度級別評估香氣強度（aroma intensity，AI）。0表示未檢測到，3表示強度中等，5表示非常強烈。對同一樣品平行測定3次，統計同一出峰位置有2次以上相似的氣味描述及其香氣強度值，最終香氣強度值為5名評價人員嗅聞記錄的香氣強度平均值[13]。

OAV值：風味物質的平均濃度與閾值之比。暫不考慮風味物質的相互影響，OAV＜1時，該物質對樣品總體氣味貢獻不明顯，反之，則此風味物質對整體風味貢獻較大，且OAV值與貢獻風味比重呈正比。通常認為OAV≥1的物質為風味活性物質[14]。

1.3.2 具有豆腥味減弱能力酵母菌的篩選

1.3.2.1 酵母菌的分離純化

將采集的發酵食品樣品在研缽中搗碎，稱取1 g研磨后的樣品加入含有9 mL無菌水的試管中，充分振蕩混勻得10倍稀釋樣液。無菌吸取1 mL10倍稀釋樣液加入含有9 mL無菌水的試管中，充分振蕩混勻得102倍稀釋樣液，照此方法依次制備103倍～106倍稀釋樣液。吸取0.1 mL 103倍～106倍4個梯度的稀釋樣液涂布于PDA培養基中，每個稀釋度設3個重復。平板于30℃恒溫倒置培養48 h后，用無菌牙簽挑選不同大小、顏色、形態的菌落在PDA培養基上反復劃線至分離得到酵母單菌落[15]。

1.3.2.2 發酵豆渣的制備

分離純化后的酵母菌用MEB培養基調整濃度至107CFU/mL～108CFU/mL后，在 10 000 r/min、4℃條件下離心10 min，棄上清液，加入無菌水振蕩混勻后在相同條件下離心棄上清液，如此重復操作2次～3次以完全洗去菌液中的培養液。在無培養液的菌體中加入等體積無菌水并混勻作為接種液。按照6%接種量接入裝有10g滅菌豆渣的150mL廣口錐形瓶中，加入30mL無菌水攪拌均勻后置于恒溫恒濕培養箱中于30℃固態發酵5 d，發酵后的樣品以RS-1～RS-20命名。空白對照組除不接種酵母菌外其余條件均和試驗組一致。

1.3.2.3 感官評價初篩具有豆腥味減弱能力的酵母菌

感官評價在標準感官實驗室進行，依據GB/T 16291.1—2012《感官分析選拔、培訓與管理評價員一般導則第一部分：優選評價員》對評價成員進行篩選和培訓，通過考察感官識別及表達能力，選擇感覺靈敏度高，表達能力強的感官評價人員16名，建立感官評價小組，其中男、女性各8名，年齡范圍在20周歲～30周歲。評價過程：稱取各酵母菌發酵后的豆渣樣品5 g于棕色不透明的帶蓋盒子中，使用隨機3位數字組合編號后呈遞給感官評價人員進行感官嗅聞。結合先前的研究基礎[16]以及感官分析參考[17]，評價人員分別對豆腥味、青草味、酸味、氧化味、氨味、豆香味、椰香、甜香、酯香、曲香共10種感官屬性進行評價。評價結果采用9分制打分（0分表示未嗅聞到，9分表示氣味極強），每個樣品重復評價3次，記錄各評價人員的評分結果，最后取平均值即為香氣強度值。

1.3.2.4 GC-MS復篩目的菌株

對于感官評價初步篩選出的發酵后豆腥味強度較低的豆渣樣品，通過GC-MS檢測進行復篩，驗證并分析各菌株豆腥味減弱效果。GC-MS分析方法及條件同1.3.1.1節。

1.3.2.5 目的菌株形態學和26S rDNA鑒定

形態學鑒定：將分離純化得到的目的菌株接種在PDA培養基上，于30℃下培養48 h，觀察并記錄菌落形態；挑選典型菌落制成水浸片，在光學顯微鏡下觀察細胞形狀[18]。

分子鑒定[6]：以目的菌株菌液為模板，采用通用引物 NL1（5’-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3’）和 NL4（5’-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3’）進行 26S rDNA的聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）擴增。擴增體系為 50 μL（NL1 和 NL4 各 2 μL，ddH2O19 μL，菌液 2 μL，2×GoodStar Best Master Mix 25 μL）。PCR擴增條件：95℃預變性10 min，95℃變性30 s，55℃退火 30 s，72℃延伸 20 s，共 30個循環，最終72℃延伸5 min，4℃保溫。得到的PCR產物用1%的瓊脂糖凝膠電泳進行檢測后送至上海生工生物工程有限公司完成測序，將測得的序列在NCBI中進行生物大分子序列比對（basic local alignment search tool，BLAST）比對。利用MEGA6.0對所測菌株與該菌屬內其他菌株序列進行系統發生樹的構建。

1.3.3 目的菌株在豆渣飲料中的應用

1.3.3.1 豆渣飲料的制備

豆渣飲料制作工藝見圖1。

圖1 豆渣飲料制作工藝流程Fig.1 Process flow chart of making bean dregs beverage

1.3.3.2 豆渣飲料的感官評價與豆腥味化合物分析

采用未發酵、初篩所得菌株和目的菌株發酵后的豆渣為主要原料分別制備飲料樣品，對各組飲料樣品分別進行豆腥味感官評價以及豆腥味化合物GC-MS檢測分析并進行比較。GC-MS分析方法及條件同

1.3.1.1，感官評價方法同1.3.2.3。

1.3.4 數據處理

數據采用SPSS 21進行單因素方差分析，利用鄧肯多重檢驗評定樣品間差異性，當p＜0.05時有顯著性差異；利用獨立樣本t檢驗對豆腥味化合物含量間的差異性進行分析。采用Origin Pro 9.0對感官評價結果作圖。

2 結果與分析

2.1 豆渣中主要豆腥味化合物的確定

新鮮豆渣中鑒定出的主要豆腥味化合物見表1。

表1 豆渣中鑒定出的主要豆腥味化合物Table 1 The main beany odor compounds identified in okara

由表1可知，新鮮豆渣（未發酵）中己醛、己醇、壬醛、2-正戊基呋喃、1-辛烯-3-醇、（E）-2-辛烯醛、（E）-2-庚烯醛、（E）-2-己烯醛8種物質對豆渣豆腥味貢獻最大。其中，醛類物質在檢出種類及含量上均占較高比例，己醛在所有揮發性組分中含量最高，為1 834.2 μg/kg，是造成豆渣豆腥味嚴重的主要風味物質之一[20]。研究表明，豆渣不良風味如豆腥味和苦澀味的形成主要與大豆在研磨過程中發生的酶促反應相關[21]。當大豆在25℃左右浸泡和研磨時，大豆細胞破裂使得脂肪氧合酶與處于隔離狀態的脂質及其它生物活性物質發生接觸，并利用空氣中的分子氧、溫度等因素迅速發生氧化反應，從而產生大量揮發性風味物質如醛類、酮類、醇類等，這些物質只要微量存在，就會產生令人不愉快的氣味[22]。

本試驗結果與李慧勤等[23]的研究結果一致。此外，本試驗還確定了己醇、（E）-2-辛烯醛、（E）-2-己烯醛3種豆腥味香氣活性化合物，它們同樣對豆渣豆腥味的形成產生重要影響。盡管這些物質在單獨存在時會表現出生豆味、青草味、嫩葉味等，但它們在豆渣體系中混合以后產生的嗅覺綜合效應則會變為明顯的豆腥味[24]。

2.2 感官評價初篩結果

各菌株發酵樣品的定量描述感官評價結果見圖2。

圖2 未發酵與20個發酵豆渣樣品感官評價雷達圖Fig.2 Sensory evaluation radar chart of unfermented and 20 fermented okara samples

由圖2可知，其中有20個發酵樣品的豆腥味評分低于未發酵豆渣，表明對應的20株酵母菌可能有改善豆渣豆腥味的作用。這20個發酵豆渣樣品呈現不同的香氣輪廓特征，可能的原因是酵母菌生理生化能力如產酸、產酯、耐鹽等的不同[25-26]。因此，它們以豆渣為底物發酵所產生的代謝產物在種類和含量上也存在一定的差異，進而影響發酵豆渣風味。其中，RS-3、RS-5、RS-8、RS-10、RS-13、RS-14，6 個發酵樣品的豆腥味評分與未發酵樣品相比顯著降低（p＜0.01），總體接受度評分明顯提高，因此選擇這6個發酵豆渣樣品進行下一步的GC-MS復篩分析。

2.3 GC-MS復篩結果

通過GC-MS對1個未發酵樣品及初篩得到的6個發酵豆渣樣品進行分析，鑒定出的揮發性化合物種類及含量見表2。

表2 豆渣樣品中揮發性化合物種類及含量Table 2 Types and contents of volatile compounds in okara samples

續表2 豆渣樣品中揮發性化合物種類及含量Continue table 2 Types and contents of volatile compounds in okara samples

由表2可知，在7個豆渣樣品中共鑒定出51種香氣成分，主要包括醇類、醛類、酯類、酮類、酸類等。其中，醇類物質在未發酵豆渣樣品中含量較低，但在經酵母菌發酵后的多數樣品中苯乙醇、2-乙基己醇和異戊醇的含量有所增加。它們由酵母菌分解脂肪酸產生[27]，閾值較低，具有甜香及花香，對豆腥味起一定的掩蓋作用[28]。醛類化合物的閾值通常較低，也是豆渣豆腥味的主要來源[29]。庚醛、（E）-2-辛烯醛、（E）-2-庚烯醛、壬醛已被證實是許多豆類制品中的典型豆腥味物質[30-32]，這些物質均未在發酵后的樣品中檢出。在6個發酵豆渣樣品中檢出的醛類物質包括己醛、3-甲基丁醛和苯甲醛，它們是由酵母菌在發酵過程中分解不飽和脂肪酸形成的過氧化物裂解產物[33]。其中己醛是對豆渣豆腥味貢獻最大的關鍵化合物，其含量可作為衡量豆腥味的指標，與未發酵樣品相比，發酵后的樣品中該物質的含量顯著降低（p＜0.05）[34-36]。RS-3和 RS-13菌株發酵后的豆渣中未檢出己醛，表明這兩株酵母菌的豆腥味減弱能力較其它4株更佳。經6株酵母菌發酵后，豆渣中酯類物質含量有所增加。其中RS-13發酵樣品中酯類物質的種類及含量增加最為明顯，發酵過程新生成γ-己內酯、乙酸乙酯、乙酸苯乙酯等，相對含量提高約40%。酯類物質絕大部分都帶有濃郁的果香、奶香及花香等，可有效掩蓋豆腥味，提高樣品的整體可接受度[37-38]。酮類物質對豆渣氣味的貢獻相對較小[39]。對于酸類，6個發酵樣品中己酸、戊酸及冰醋酸的含量較多，這些酸通常具有酸臭味，會影響豆渣樣品的整體接受度。RS-13發酵樣品中酮類和酸類物質含量均較低，因此帶來的不良風味弱，相較于其它發酵豆渣樣品整體風味更佳。

未發酵及6株酵母菌發酵后的豆渣樣品中主要豆腥味化合物含量如圖3所示。

圖3 未發酵及發酵豆渣樣品中豆腥味化合物總含量Fig.3 Content of beany flavor compounds in unfermented and fermented okara samples

由圖3可知，經酵母菌發酵后的豆渣樣品中主要豆腥味化合物含量均下降明顯，與未發酵豆渣相比具有顯著性差異（p＜0.05）。其中RS-13發酵后的豆渣樣品中8種主要豆腥味成分總含量降至57.22 μg/kg，僅為未發酵豆渣的1/40，在所選菌株中豆腥味減弱效果最佳。基于以上分析，確定RS-13為目的菌株，進行下一步的形態學及基因序列測定分析。

2.4 目的菌株RS-13形態學及26S rDNA鑒定結果

RS-13的形態學特征見圖4。

圖4 RS-13的形態學特征（1 000×）Fig.4 Morphological character of RS-13（1 000×）

對RS-13的基因序列進行測定，26S rDNA結果顯示RS-13與菌株Pichia fermentans GQ（Sequence ID：GQ458040）的同源性最高，高達99%，相似度＞95%，因此判斷該菌種為發酵畢赤酵母，利用MEGA 6.0軟件構建的系統發生樹見圖5。

圖5 RS-13基于26S rDNA基因的系統發生樹Fig.5 RS-13 phylogenetic tree based on 26S rDNA gene

2.5 目的菌株RS-13在豆渣飲料中的應用

為驗證目的菌株RS-13對豆渣制品豆腥味改良效果，分別采用未發酵豆渣、初篩所得菌株RS-3（初篩結果中該菌株豆腥味減弱效果同樣較佳，故選其作為對比）和目的菌株RS-13發酵后的豆渣作為原料制備豆渣飲料，并對飲料成品進行主要豆腥味化合物含量測定及豆腥味定量描述感官評價，分析結果見表3。

表3 未發酵豆渣飲料與發酵豆渣飲料中主要豆腥味化合物含量及豆腥味感官評分比較Table 3 Comparison of the beany flavor compounds content and sensory scores of unfermented and fermented okara beverages

由表3可知，與未發酵豆渣飲料及其它菌株發酵豆渣飲料相比，采用RS-13發酵豆渣制備而成的豆渣飲料中主要豆腥味化合物含量及豆腥味評分最低。表明RS-13菌株對于發酵豆渣飲料同樣具有明顯的豆腥味減弱效果，可將其應用于豆渣制品中進行豆腥味的改善。

3 結論

以豆渣為研究對象，通過HS-SPME-GC-MS、GCO測定以及OAV分析，確定新鮮豆渣中8種主要豆腥味化合物為己醛、己醇、壬醛、（E）-2-己烯醛、2-正戊基呋喃、1-辛烯-3-醇、（E）-2-辛烯醛、（E）-2-庚烯醛。分析不同酵母菌發酵對豆渣揮發性成分以及感官屬性尤其是豆腥味的影響，發現RS-13菌株發酵樣品的主要豆腥味化合物總量最低，只有未發酵樣品的1/40；此外，使用該菌株發酵后的豆渣樣品中還生成多種醇類、酯類物質，對于整體的風味特征有明顯改善及促進作用。經形態學和26S rDNA鑒定，該菌株為發酵畢赤酵母（Pichia fermentans）。將該菌株應用于豆渣飲料的制備，可以有效減弱飲料成品的豆腥味，提高整體可接受度。本研究為豆渣豆腥味的去除提供參考，也為提高豆渣綜合利用率及其產業化發展提供了一定的理論依據。