HPLC法同時測定五味祛脂顆粒中三種成分

李芳嬋，龐曉云，付吉利，陳 清，王蘇妃，魏博偉

（1.廣西中醫藥大學，南寧 530200；2.廣西壯瑤藥工程技術研究中心，南寧 530200；3.廣西中醫藥大學制藥廠，南寧 530000）

五味祛脂顆粒是廣西中醫藥大學擬開發的廣西壯族自治區（簡稱廣西）特色壯瑤藥保健食品，由廣西藤茶、決明子、葛根、荷葉、百合等藥食同源藥材組方，可通調龍路、火路，同時兼以扶正補虛，諸癥兼顧，相得益彰，具有清熱毒、祛濕毒、利水道的功效，通過調節機體的代謝機能，從而達到多靶點、多環節整體協調降血脂的作用。葛根素、二氫楊梅素及楊梅素分別是葛根、藤茶降脂的重要活性成分，本研究采用高效液相色譜法測定產品中葛根素、二氫楊梅素、楊梅素成分的含量，建立五味祛脂顆粒質量控制方法，為控制產品的質量提供依據。

1 材料與方法

1.1 儀器

1260 InfinityⅡ型高效液相色譜儀（美國Agilent公司），Direct-Q 5UV型超純水機（廣西南寧市博美生物科技有限公司），KQ-500E型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 試藥

五味祛脂顆粒，廣西中醫藥大學；楊梅素（PLC≥98.31%）、二氫楊梅素（HPLC≥99.57%），成都曼思特生物科技有限公司；葛根素，上海融禾醫藥科技有限公司；甲醇（色譜純）、乙腈（色譜純），賽默飛世爾科技有限公司；磷酸，成都金山化學試劑有限公司。

1.3 方法

1.3.1 色譜條件 色譜柱：Shim-pack C1（8250.0 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相為乙腈（A）-0.1%磷酸水（B），梯 度 洗 脫 ：0～15 min，15%A→26%A；15～25 min，26%→50%；采用轉換波長測定，0～9 min，波長為250 nm，9～25 min，波長為285 nm；進樣量5 μL，柱溫30℃。

1.3.2 對照品溶液的制備 取葛根素、二氫楊梅素、楊梅素對照品適量，加入甲醇制成濃度為0.023 0、0.543 6、0.250 4 mg/mL的葛根素、二氫楊梅素、楊梅素混合對照品溶液。

1.3.3 供試品溶液的制備 取五味祛脂顆粒0.2 g，研細，過80目篩，精密稱定，置于錐形瓶中，精密加入甲醇20 mL，稱重，超聲提取30 min，補重，過濾，取續濾液過0.22 μm微孔濾膜，得到五味祛脂供試品溶液。

取缺藤茶陰性樣品0.2 g，精密稱定，同五味祛脂供試品溶液制備方法，制備缺藤茶陰性對照品溶液。

取缺葛根陰性樣品0.2 g，精密稱定，同五味祛脂供試品溶液制備方法，制備缺葛根陰性對照品溶液。

1.3.4 專屬性考察 分別精密吸取對照品溶液、供試品溶液和陰性樣品溶液各5 μL，按“1.3.1”色譜條件進樣，記錄峰面積。

1.3.5 標準曲線繪制 分別吸取二氫楊梅素對照品溶液2、4、6、8、10、12 μL，按“1.3.1”色譜條件進樣測定，記錄峰面積。

1.3.6 穩定性試驗 取五味祛脂顆粒0.2 g，精密稱定，按“1.3.3”方法制備供試品溶液，按“1.3.1”色譜條件分別于0、2、4、8、12、24 h進樣測定，記錄峰面積，計算RSD。

1.3.7 精密度試驗 取混合對照品溶液，按“1.3.1”色譜條件進樣測定，連續進樣6次，記錄峰面積，計算RSD。

1.3.8 重復性試驗 取五味祛脂顆粒0.2 g（6份），按“1.3.3”方法制備供試品溶液，按“1.3.1”色譜條件操作進樣，記錄峰面積，計算五味祛脂顆粒中葛根素、二氫楊梅素、楊梅素的含量和RSD。

1.3.9 加樣回收試驗 稱取6份五味祛脂顆粒各0.1 g，置于具塞錐形瓶中，以葛根素、二氫楊梅素、楊梅素濃度分別為0.062 0、0.298 8、0.140 0 mg/mL混合對照品溶液代替甲醇，按“1.3.3”方法制備供試品溶液，按“1.3.1”色譜條件進樣，記錄峰面積，計算加樣回收率，計算RSD。

1.3.10 樣品測定 精密稱取6批五味祛脂顆粒產品各0.2 g，按“1.3.3”方法制備供試品溶液，按“1.3.1”色譜條件操作，記錄峰面積。

2 結果與分析

2.1 專屬性考察

五味祛脂顆粒HPLC混合對照品、供試品溶液的HPLC色譜見圖1。陰性樣品在目標成分色譜峰位置的峰面積與供試品目標成分的峰面積之比＜5%，表明陰性樣品對檢測無干擾，該方法專屬性良好。

圖1 五味祛脂顆粒混合對照品溶液、供試品溶液的HPLC色譜

2.2 標準曲線繪制

以質量為橫坐標（x），峰面積為縱坐標（y），建立線性回歸方程。其線性范圍、標準曲線和相關系數詳見表1。由表1可知，葛根素、二氫楊梅素、楊梅素分別在0.023 0～0.138 0、1.087 2～6.523 2、0.500 8～3.004 8 μg水平上線性良好。

表1 五味祛脂顆粒3種成分的標準曲線和相關系數

2.3 穩定性試驗

經測定，葛根素、二氫楊梅素和楊梅素峰面積的RSD分別為2.297%、0.703%、0.635%，表明供試品溶液在24 h內穩定性良好。

2.4 精密度試驗

經測定，葛根素、二氫楊梅素和楊梅素峰面積的RSD分別為1.350%、0.121%、0.145%，表明儀器精密度良好。

2.5 重復性試驗

經檢驗，葛根素含量的RSD為3.811%；二氫楊梅素含量的RSD為3.567%；楊梅素含量的RSD為2.253%，表明該方法重復性良好。

2.6 加樣回收試驗

加樣回收試驗結果見表2。葛根素、二氫楊梅素、楊梅素的平均回收率分別為102.7%、101.1%、99.7%，RSD分別為2.56%、2.21%、0.78%，說明該方法回收率符合要求。

表2 加樣回收試驗結果

2.7 樣品測定

樣品測定結果見表3。從表3可以看出，6批五味祛脂顆粒中，葛根素、二氫楊梅素、楊梅素的平均含量分別為1.67、76.43、27.81 mg/g。考慮到藥材的復雜性，限度按平均值下調20%，暫定五味祛脂顆粒中葛根素、二氫楊梅素、楊梅素含量不得少于1.34、61.14、22.25 mg/g。

表3 6批五味祛脂顆粒測定結果 （單位：mg/g）

3 小結與討論

3.1 含量測定指標的選擇

藤茶含有豐富的多酚和黃酮類物質，其中黃酮類的二氫楊梅素含量最高，是藤茶保健作用的重要物質基礎［1-3］。二氫楊梅素能降低動物血脂，改善脂代謝紊亂，增強機體抗氧化能力，減輕高脂肪對肝細胞的損傷作用，其作用機制可能是二氫楊梅素激活SIRT1-AMPK通路，抑制脂質合成，促進脂質分解或與促進WAT棕色化有關［4-8］。楊梅素也是藤茶的活性成分，楊梅素的促脂解作用可能是通過激活PKCMEK/ERK信號通路，增加該通路中p-HSL的表達量來實現的，并可能對cAMP/PKA信號通路中相關因子的活性有一定的抑制作用［9］。葛根主要化學成分有葛根素、葛根素木糖甙、大豆黃酮和大豆黃酮甙等，其中葛根素為其重要的活性化學物，能有效降低大鼠血清中甘油三脂、膽固醇、低密度脂蛋白含量而明顯升高HDL含量，與HDL-C/TC相比，具有明顯的降脂作用［10，11］。胡彥武等［12］研究發現，葛根素可顯著調節AS大鼠血脂水平，顯著降低血清炎癥因子水平，其作用機制可能與抑制MAPK信號通路激活有關。因此，本研究選擇二氫楊梅素、楊梅素、葛根素含量測定作為五味祛脂顆粒含量測定指標，為五味祛脂顆粒研發及質量控制提供研究基礎。

3.2 色譜條件選擇

波長選擇：采用二極管陣列檢測對樣品進行測定，發現二氫楊梅素和楊梅素最大吸收波長為285 nm，葛根素最大吸收波長為250 nm，故選擇0～9 min檢測波長為250 nm，9～25 min檢測波長為285 nm。柱溫選擇：考察了柱溫25、30、35℃對樣品檢測的影響，在25℃時，二氫楊梅素的峰型不好；30、35℃時，峰型較好，但根據柱效與柱溫間的關系，選擇較低的柱溫可得到較高的柱效，本試驗選擇柱溫為30℃。流動相選擇：考察了乙腈-水、甲醇-水、乙腈-0.1%磷酸、乙腈-0.2%磷酸等流動相，選擇乙腈-水、甲醇-水為流動相時峰型不好，拖尾現象嚴重，乙腈-0.1%磷酸，乙腈-0.2%磷酸為流動相時分離度良好，峰對稱性較好，但高濃度的磷酸對管路和柱子損傷較大，故選擇乙腈-0.1%磷酸為流動相。

3.3 小結

本方法穩定性強、重復性好、準確度高，可以作為五味祛脂顆粒葛根素、二氫楊梅素、楊梅素含量測定的方法。通過6批五味祛脂顆粒含量的測定，結果表明，五味祛脂顆粒中葛根素、二氫楊梅素、楊梅素含量不得少于1.34、61.14、22.25 mg/g。