茯苓HPLC指紋圖譜的建立及三萜酸含量測定

徐雨生，袁定陽，劉 玲，辛文鋒，余正勇，段美娟

（1.湖南農業大學農學院，長沙 410128；2.湖南雜交水稻研究中心雜交水稻國家重點試驗室，長沙 410125；3.文山學院三七醫藥學院，云南 文山 663000）

茯苓（Poria cocos）是一種真菌類中藥，常寄生在山間喜光、喜溫的松樹根部［1］，味道甘甜，服用后作用于心、肺、腎的經絡，具有祛除濕氣、治療脾虛、緩解心緒不寧的作用，主要產于湖北省、安徽省、云南省等地。現代研究表明，茯苓酸具有增強機體抵御病毒的能力、提高肝細胞活性、抗菌等作用［2］；炮制后的茯苓主要用來預防以及治療頭痛、食欲不振、心肌梗死等疾病［3，4］。

隨著人們對健康的重視，對有關健康的保健品倍感興趣，茯苓作為藥食同源的中藥材，為醫藥保健品市場帶來了巨大的商機。目前，市場上大部分茯苓食品都只進行了簡單的加工［5］，且各地方的加工工藝存在差別，導致生產的茯苓食品質量參差不齊。中藥指紋圖譜法是研究各種中藥材中比較常見的一種色譜法，因其檢測成分較多、可分離難以分離的物質，且具有分離結果準確、效率高、試劑處理簡單、多條件分析等優點成為現代指紋圖譜技術中最常用的方法之一［6，7］。美國食品和藥物審批中心允許采用指紋圖譜控制藥材、保健品的質量［8］，世界衛生組織也在評估中藥質量方面提出建議，可以根據提供的中藥指紋圖譜，鑒定這味中藥的真偽性［9］。

本研究通過建立茯苓HPLC指紋圖譜，對11批不同產地的茯苓樣品進行指紋圖譜研究，確認茯苓樣品指紋圖譜中的特征峰三萜酸（茯苓新酸A、茯苓酸、松苓新酸），并對其含量進行測定，為鑒別茯苓藥材真偽及后期開發利用提供借鑒和參考。

1 材料與方法

1.1 儀器

800Y型粉碎機，永康市鉑歐五金儀器有限公司；HY-FA型電子天平，安徽華標檢測儀器有限公司；AK-RO-C2型超純水機，濟南艾肯環保科技有限公司；AS7240型超聲波清洗，天津奧特賽恩斯儀器有限公司；LC-2030型島津高效液相色譜儀（配置四元泵、在線脫氣機、自動進樣器、PDA檢測器），杭州科曉化工儀器設備有限公司；LX-1018型電熱恒溫鼓風干燥箱，東莞市力雄儀器有限公司。

1.2 試藥

茯苓酸（批號MUST-18072910）、松苓新酸（批號MUST-19032005）、茯苓新酸A（批號MUST-18112002），成都曼思特生物科技有限公司；甲醇為分析純（批號20180721），泰安市潤宏化工科技有限公司；乙腈為色譜純（批號20180601），濟南世紀通達化工有限公司；甲酸為分析純（批號20170909），淄博安豪化工有限公司；乙酸為分析純（批號201712101），黃驊市鵬發化工有限公司；去離子水。11批不同產地的茯苓樣品見表1。

表1 11批不同產地茯苓樣品

1.3 溶液的制備

1.3.1 混合對照品溶液的制備 精密稱取對照品茯苓新酸A 1.82 mg、茯苓酸1.90 mg、松苓新酸2.21 mg，置于2 mL的量瓶中，加入甲醇稀釋至刻度，超聲后搖勻，于0.45 μm微孔濾膜過濾，制成每毫升含茯苓新酸A 0.91 mg、茯苓酸0.95 mg、松苓新酸1.10 mg的混合對照品溶液。

1.3.2 供試品溶液的制備 取自然干燥后的茯苓，粉碎（過7號篩），精密稱定5.0 g，置于50 mL錐形瓶中，精密加入甲醇20 mL，稱量，超聲處理（功率100 W，溫度60℃）40 min，放冷，再稱量，用甲醇補足減失的量，搖勻后靜置，取上清液過濾，微孔濾膜0.45 μm，得供試品溶液。

1.4 色譜條件

使用HydroBondPS-C18色譜柱（4.6 mm×250.0 mm，5 μm），以乙腈和0.2%甲酸水溶液為流動相，依次進行梯度洗脫，梯度洗脫程序見表2。柱溫30℃，流速1.0 mL/min，進樣量20 μL，檢測波長［10］203、242 nm。以茯苓酸的保留時間和半高峰寬度計算理論塔板數，所求出的結果不得低于5 100。

表2 梯度洗脫程序

1.5 線性關系考察

取1 mL的混合對照品溶液于進樣瓶中。按“1.4”色譜條件，波長203 nm，取2、4、6、8、10、12 μL依次進樣，以三萜酸的峰面積為縱坐標，混合對照品的進樣量為橫坐標，繪制標準曲線，得到茯苓新酸A、茯苓酸、松苓新酸的線性回歸方程及相關系數。

1.6 穩定性試驗

精密吸取1 mL茯苓（云南省普洱市）供試品溶液，按“1.4”色譜條件進樣，波長242 nm，分別在配制后的0、2、4、8、12、24 h進行檢測。

1.7 精密度試驗

精密吸取1 mL茯苓（云南省普洱市）供試品溶液，按“1.4”色譜條件進樣，波長242 nm，連續檢測6次。

1.8 重復性試驗

稱取6份茯苓（云南省普洱市）樣品，按“1.3.2”方法制備供試品溶液，按“1.4”色譜條件進樣，波長242 nm處檢測。

1.9 加樣回收試驗

稱取6份茯苓（云南省普洱市）樣品，按“1.3.2”方法制備供試品溶液，每份加入0.1 mL混合對照品溶液，配制待測溶液，按“1.4”色譜條件進樣，在波長242 nm處檢測，通過測定茯苓新酸A、茯苓酸、松苓新酸的含量，計算平均加樣回收率。

1.10 供試品測定

取11批茯苓供試品溶液各1 mL，按“1.4”色譜條件進樣，在波長203 nm處檢測，為減小誤差，每批樣品都稱取3份。根據檢測獲得的數據和回歸方程，利用外標兩點法分別計算茯苓新酸A、茯苓酸、松苓新酸的平均含量。

1.11 指紋圖譜的測定與相似度分析

1.1 1.1茯苓指紋圖譜測定 按“1.4”色譜條件進樣，在波長242 nm處對11批茯苓樣品進行檢測。

1.1 1.2指紋圖譜的相關性分析 將茯苓指紋圖譜圖導入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統”軟件（2012.130723版），首先對導入的譜圖進行統一裁剪，采用多點校正的方法將各譜圖中的譜峰進行自動匹配，然后采用平均數法設置一張圖譜作為參照，再利用峰匹配形式標出樣品指紋圖譜的共有峰，最后計算出指紋譜圖的相似度。

2 結果與分析

2.1 色譜條件

分別對混合對照品溶液和供試品溶液進行測定（圖1），結果顯示，各峰分離較好，達到了預期的效果。

圖1 混合對照品溶液（a）和茯苓供試品溶液（b）的HPLC色譜

2.2 線性關系考察

以三萜酸的峰面積為縱坐標，混合對照品的進樣量為橫坐標，繪制標準曲線，得到茯苓新酸A、茯苓酸、松苓新酸的線性回歸方程及相關系數（r）見表3。說明2個變量之間具有較好的相關性。

表3 茯苓三萜酸的回歸方程、相關系數及線性范圍

2.3 穩定性試驗

根據數據計算得知，茯苓新酸A、茯苓酸、松苓新酸峰面積的RSD分別為0.79%、0.98%、0.63%，相應峰相對保留時間RSD分別為1.71%、2.52%、1.44%。說明24 h內溶液的性質沒有產生太大變化，表明該方法具有較好的穩定性。

2.4 精密度試驗

茯苓新酸A、茯苓酸、松苓新酸相應峰面積RSD分別為1.98%、2.14%、1.45%，相應峰相對保留時間RSD分別為1.52%、2.21%、1.26%。從結果可以得出，三萜酸的各RSD很相近，且RSD沒有超過3%，說明儀器在檢測過程中具有較好的精密度。

2.5 重復性試驗

分別將三萜酸的峰面積代入相關回歸方程（表3）計算三萜酸含量，并計算其平均值（去除最大值和最小值）。茯苓新酸A、茯苓酸、松苓新酸的平均含量分別為1.87、2.21、1.64 mg/g，峰面積RSD分別為1.62%、1.78%、1.15%，相對保留時間RSD分別為2.51%、2.19%、1.63%，表明該方法重復性較高。

2.6 加樣回收試驗

茯苓新酸A、茯苓酸、松苓新酸的平均加樣回收率 分別為99.32%、99.85%、99.01%，RSD分別 為1.36%、0.95%、1.51%，說明該方法的回收率較高。

2.7 供試品測定

不同茯苓樣品中茯苓新酸A、茯苓酸、松苓新酸的平均含量測定見表4。將檢測獲得的數據利用回歸方程分別計算出茯苓新酸A、茯苓酸、松苓新酸的含量，并計算其平均值（去除最大值和最小值）。

表4 不同地區茯苓樣品中茯苓新酸A、茯苓酸、松苓新酸的平均含量 （單位：mg/g）

2.8 指紋圖譜的測定與相似度分析

2.8.1 茯苓指紋圖譜測定 茯苓中的共有峰色譜見圖2。通過“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統”軟件得知，11個地區的茯苓共有峰是1～11號，分別確認1～11號色譜峰為茯苓的特征峰。結果顯示，茯苓新酸A、茯苓酸、松苓新酸分離效果比較好，且峰面積大，所以選擇茯苓新酸A、茯苓酸、松苓新酸為參照峰（S）。

圖2 茯苓中的共有峰色譜

2.8.2 指紋圖譜的相關性分析 不同地區茯苓HPLC指紋色譜見圖3，色譜的相似度評價結果見表5。在11個地區的茯苓中，只有安徽省岳西縣和湖北省英山縣的相似度小于0.800，其他樣品的相似度都大于0.800，差別不大，11個地區的茯苓中都能檢出1～11個色譜峰，說明各地區的茯苓成分相關性良好，在本試驗色譜條件下建立的茯苓指紋圖譜指標穩定。

圖3 不同地區茯苓HPLC指紋色譜

3 小結與討論

3.1 提取方法的選擇

超聲波提取方法具有效果好、速度快的特點，且超聲時間一般較短、溫度較低。部分藥材高溫時化學物質容易分解，會損失較多的有效成分，超聲提取能避免有效成分的破壞，因此適用于很多類中藥材和各組分的提取。藥材溶液通過超聲提取后，固體物質溶解快速，有效成分分離明顯。超聲波提取簡單易操作，所以本研究采用超聲提取的方法，使茯苓的有效成分能更好地分離出來。

3.2 流動相的選擇

通過查閱文獻得知主要有4種流動相，其中，甲醇-水溶液條件下分離出的色譜峰效果不好，乙腈-去離子水溶液條件下的峰面積比較小，乙腈-0.2%乙酸水溶液條件下的分離效果不好，乙腈-0.2%甲酸水溶液條件下的分離效果較好［11，12］。為達到最佳的分離效果，本研究選擇乙腈-0.2%甲酸水溶液流動相并不斷改變洗脫比例，進而得到較好的指紋圖譜。

3.3 檢測波長的選擇

從色譜圖來看，以203 nm為檢測波長時，基線變化不大，測定混合對照品溶液時3種酸的峰形非常明顯；但測供試品溶液時峰數目少，圖譜效果不佳。以242 nm為檢測波長時，基線波動大，峰數目較多，分離效果、譜圖效果較好，但采用242 nm波長測定混合對照品溶液時，茯苓酸峰形不明顯。因此，線性關系考察及供試品溶液測定時選用203 nm為檢測波長，其余均選擇242 nm為檢測波長。

3.4 11個地區的茯苓指紋圖譜比較分析

對比分析11個地區的茯苓相似度，發現除安徽省岳西縣和湖北省英山縣外，其余9個地區的茯苓都具有較高的相似度。通過“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統”軟件進行峰匹配，發現11個地區的茯苓中都存在11個共有峰，并且茯苓新酸A、茯苓酸、松苓新酸的峰形較為明顯，也從側面反映出它們的含量較高，3個峰的相對保留時間較近，說明在本試驗條件下，可以獲得較好的茯苓指紋圖譜。安徽省岳西縣和湖北省英山縣相似度相對較低，可能是茯苓的收獲時節、生長環境、保存方法等方面的原因，但缺乏相關研究，需要進一步探索。

3.5 三萜酸的含量比較

通過建立指紋圖譜和回歸方程，鑒定并檢測了三萜酸（茯苓新酸A、茯苓酸、松苓新酸）含量。三萜酸含量表現為四川省西昌市＞安徽省亳州市＞貴州省凱里市＞云南省楚雄市＞河南省新鄉市＞湖南省懷化市＞廣西省賀州市＞云南省怒江傈僳族自治州＞云南省普洱市＞安徽省岳西縣＞湖北省英山縣。研究表明，四川省西昌市和安徽省亳州市這2個地區茯苓中的三萜酸含量比其他地區高，如果只考慮三萜酸含量這個因素，可以認定這2個地區的藥材質量優于其他地區。通過檢測不同地區的茯苓，三萜酸含量有的相差很小，有的相差很大，但是三萜酸含量依然可以作為評價茯苓藥材質量的指標之一，為購買優質的茯苓提供選擇產地的試驗依據。