銀菊止癢洗液HPLC特征指紋圖譜及聚類分析

謝 巍，楊 妮，肖 萍，盧森華，莫禮艷

（1.柳州市婦幼保健院/廣西科技大學附屬婦產醫院兒童醫院，廣西 柳州 545001；2.玉林市食品藥品檢驗檢測中心，廣西 玉林 537000）

銀菊止癢洗液由金銀花、野菊花、蛇床子、苦參等7味中藥組成，是柳州市婦幼保健院多年來在臨床用藥經驗和辯證施治原則的基礎上總結的有效方劑。其中，野菊花具有疏散風熱、清肝明目、解毒的功效，金銀花具有宣散風熱、清解血毒的功效，蛇床子具有燥濕、祛風、殺蟲的功效［1］，諸藥合用具有清熱燥濕、解毒止癢的療效，可廣泛應用于小兒腠理失和、濕熱內蘊所致的濕疹。該方劑中的主要化學成分有綠原酸、咖啡酸、蒙花苷、蛇床子素等［2-4］，據相關文獻報道，綠原酸、咖啡酸、蒙花苷、蛇床子素具有較強的抗細菌、炎癥、真菌、心肌纖維化、病毒等作用［5-8］，提示其可能為銀菊止癢洗液的活性成分。

國內外有許多學者對上述化學成分進行了含量測定研究［9-12］，這些研究對銀菊止癢洗液的質量控制有很好的指導意義，但中藥制劑組成復雜多變，僅僅依靠含量測定難以全面評價中藥制劑質量。而指紋圖譜卻能突出中藥制劑的完整面貌，并且同類制劑的指紋圖譜具有相似性，依靠圖譜可以實現對中藥制劑內在化學成分的綜合評價以及整體質量的全面控制，使中藥制劑的成分更加可控［13］。系統聚類分析能通過數學處理方法替代傳統靠經驗和專業知識來進行分類工作［14］。為全面控制銀菊止癢洗液質量，本研究擬通過HPLC特征指紋圖譜法結合系統聚類分析的方法對不同批次銀菊止癢洗液展開研究，為銀菊止癢洗液的質量控制提供依據和參考。

1 材料與方法

1.1 儀器

U3000型高效液相色譜儀（美國Thermo Fisher公司）；HH-S6型恒溫數顯水浴箱（金壇市醫療儀器廠）；KQ-500GDV型超聲清洗儀（昆山市超聲儀器有限公司）；Synergy型超純水機（美國默克公司）；FW80型高速萬能粉碎機（天津市泰斯特儀器有限公司）；XS-205Du型電子分析天平（瑞士METTLERTOLEDO公司）。

1.2 藥品與試劑

銀菊止癢洗液源于柳州市婦幼保健院；綠原酸（純度99.3%）、蒙花苷（純度95.1%）、咖啡酸（純度96.2%）、蛇床子素（純度98.2%），中國食品藥品檢定研究院；正丁醇（AR），東莞市今勝化工有限公司；甲醇（色譜純）、乙腈（色譜純），德國默克公司；去離子水，Synergy超純水機制作。

1.3 方法

1.3.1 色譜條件 采用CAPCELL PAK C18MGⅡ色譜柱（4.6 mm×250.0 mm，5 μm），流動相為甲醇（A）-0.2%磷酸水溶液（B），梯度洗脫程序見表1。檢測波長330 nm，柱溫25℃，流速1.0 mL/min，進樣量5 μL。

表1 流動相梯度洗脫程序

1.3.2 溶液制備

1）溶液制備。精密稱取綠原酸、咖啡酸、蒙花苷、蛇床子素對照品各10 mg，分別置于10 mL容量瓶中，用甲醇超聲溶解，定容至刻度，得到單一對照溶液。分別精密量取單一對照品溶液各1.0 mL，置于10 mL容量瓶中，用甲醇稀釋定容至刻度，即得混合對照品溶液。

2）供試品溶液制備。精密量取銀菊止癢洗液20.0 mL置于分液漏斗中，用水飽和正丁醇萃取3次，每次25 mL，合并正丁醇層，再用正丁醇飽和的水萃取2次，每次25 mL，棄去水洗液，合并正丁醇層，水浴蒸干，用甲醇溶解，置于5 mL量瓶中，加甲醇定容稀釋至刻度，用0.45 μm微孔濾膜過濾，即得供試品溶液。

1.3.3 精密度試驗 精密量取銀菊止癢洗液20 mL，按照“1.3.2”方法制備供試品溶液，依“1.3.1”色譜條件，連續進樣6次，記錄圖譜及峰面積，以A15為參照峰，分別計算銀菊止癢洗液中共有峰相對保留時間和相對峰面積RSD。

1.3.4 重復性試驗 分別精密量取同一批次銀菊止癢洗液樣品6份，每份20 mL，按照“1.3.2”方法制備供試品溶液，依“1.3.1”色譜條件進樣分析，記錄圖譜及峰面積，以A15為參照峰，計算銀菊止癢洗液中共有峰相對保留時間和相對峰面積RSD。

1.3.5 穩定性試驗 精密量取銀菊止癢洗液樣品20 mL，按照“1.3.2”方法制備供試品溶液，依“1.3.1”色譜條件分別于1、2、4、6、8、12 h，連續進樣6次，記錄圖譜及峰面積，以A15為參照峰，計算銀菊止癢洗液中共有峰相對保留時間和相對峰面積的RSD。

2 結果與分析

2.1 精密度試驗

精密度試驗結果表明，銀菊止癢洗液樣品中15個共有峰的相對保留時間的RSD為0.04%～0.40%，相對峰面積的RSD為0.05%～1.50%，表明儀器的精密度良好。

2.2 重復性試驗

重復性試驗結果表明，共有峰的相對保留時間的RSD為0.04%～0.60%，相 對 峰 面 積 的RSD為0.50%～1.80%，表明該試驗方法重復性良好。

2.3 穩定性試驗

穩定性試驗結果顯示，相對保留時間RSD為0.04%～0.50%，相對峰面積RSD為0.07%～2.00%，說明供試品溶液在12 h內穩定性良好。

2.4 HPLC特征指紋圖譜的建立

2.4.1 不同批次銀菊止癢洗液的指紋圖譜采集 分別精密量取銀菊止癢洗液20 mL，按照“1.3.2”方法制備供試品溶液，依“1.3.1”色譜條件進樣分析，記錄12批銀菊止癢洗液樣品的HPLC色譜圖譜、保留時間和峰面積。將12批銀菊止癢洗液樣品的圖譜及數據導入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統”［15］，建立銀菊止癢洗液疊加HPLC色譜（圖1）。共獲得15個共有峰（編號為A1～A15），以蛇床子素色譜峰（15號峰）為參照峰，指認了14個共有峰。對照色譜、共有模式指紋圖譜、HPLC疊加色譜分別見圖1、圖2、圖3。

圖1 混合對照品色譜

圖2 銀菊止癢洗液對照指紋圖譜

圖3 12批銀菊止癢洗液HPLC疊加色譜

2.4.2 共有峰和指紋圖譜確定 采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統A版（2004）》軟件對HPLC數據進行處理。自動匹配指紋圖譜數據的相關參數，標定銀菊止癢洗液共有峰，并生成對照指紋圖譜。本研究共標定了15個共有峰，參照圖譜選擇樣品，時間窗寬度設定為0.1 min，多點校正并自動匹配譜峰，采用中位數法生成對照指紋圖譜。把參照峰A15的峰面積看作1，分別計算不同批次銀菊止癢洗液共有峰的相對保留時間和峰面積，并根據指紋圖譜共有模式計算相似度（表2）。結果顯示，相對峰面積的RSD為6.40%～35.50%，相對保留時間的RSD為0.03～0.40%，相似度在0.963～0.999。

表2 銀菊止癢洗液HPLC特征指紋圖譜相似度評價結果

2.5 系統聚類分析

采用SPSS 19.0軟件進行系統聚類分析，以12批不同批次銀菊止癢洗液序號為橫向列，以15個共有特征峰為縱向列，以各自對應相對峰面積為指標，組成12×15原始數據表，先將數據進行Z得分標準化處理，再以平方Euclidean距離為度量標準，采用組間對比和距離公式作為樣品的測度進行系統聚類分析（圖4）。結果表明，當距離標尺為5時，12批銀菊止癢洗液樣品被分為4類，其中S3、S7和S12聚為第一類，S1、S5、S8、S10、S2和S11歸為第二類，S4和S6聚為第三類，S9單獨歸為第四類；當距離標尺為10時，12批銀菊止癢洗液樣品被分為3類，其中，S4和S6歸為第一類，S1、S2、S5、S8、S10和S11聚為第二類，S3、S7、S9和S12聚為第三類；當距離標尺為25時，樣品被分為2類，S4和S6歸為一類；其他歸為一類。

圖4 銀菊止癢洗液樣品聚類分析

2.6 主成分分析

利用SPSS 19.0軟件，以銀菊止癢洗液的15個共有峰的峰面積為指標，對共有峰面積進行標準化處理后再進行主成分分析，分別得到主成分特征值、方差貢獻率和累計方差貢獻率。結果2個主成分的特征值為10.170和3.158，均大于1，方差貢獻率分別為67.797%和21.055%，2個主成分累積方差貢獻率為88.852%。表明這2個成分是影響銀菊止癢洗液的主要因子，基本反映出銀菊止癢洗液的質量評價指標，故選擇提取前2個主成分進行分析。

將得到的2個因子的成分矩陣進行正交旋轉處理，得到主成分因子1大于0.9的有1號峰（0.937）、2號峰（0.968）、4號峰（0.961）、5號峰（0.952）、7號峰（0.960）。 主 成 分 因 子2大 于0.9的 有 ：10號 峰（0.925）、11號峰（0.948）。其中因子1的2號峰（綠原酸）和因子2的11號峰（蒙花苷）對主成分貢獻最大，根據旋轉成分矩陣可推測綠原酸、蒙花苷對銀菊止癢洗液制劑品質有明顯的影響，可作為銀菊止癢洗液質量評價指標。

將上述2個因子分別乘以對應的標準化處理后峰面積，分別得到因子1（F1）、因子2（F2）得分，再分別乘以各自方差貢獻率除以累積方差貢獻率，即可得到不同批次銀菊止癢洗液的綜合得分（F），制劑的整體質量越好綜合得分越高。綜合得分最高的前3名樣品為S6、S9和S4，當綜合得分大于10.989時S6、S9、S4聚為一類。當綜合得分小于于10.989時S10、S2、S12、S1、S7、S5及S3歸為一類，與聚類分析中距離標尺為25時分類基本一致，具體結果見表3。

表3 12批銀菊止癢洗液制主成分得分、綜合得分及排名

3 小結

前期的研究建立了銀菊止癢洗液中4個化學成分含量測定方法［16］，為全面控制銀菊止癢洗液質量，本研究結合含量測定方法和色譜條件，建立了12批銀菊止癢洗液指紋HPLC圖譜分析方法。根據色譜圖的峰分離效果以及峰面積標定了15個共有峰，并指認了其中4個共有峰，進一步結合相似度評價，計算了不同批次銀菊止癢洗液的質量。結果表明，本研究所建立的HPLC指紋圖譜法準確、穩定、重現性好、專屬性強，有效地補充了含量差異的不足。同時，也存在著不足之處，指紋圖譜采用含量測定色譜條件，各色譜峰相對集中，要達到很好的分離效果，對色譜柱提出了較高的要求。

聚類分析結果顯示，當距離標尺為5時，12批銀菊止癢洗液樣品被分為4類，其中S3、S7和S12聚為第一類，S1、S5、S8、S10、S2和S11歸為第二類，S4和S6聚為第三類，S9為第四類。提示在生產過程中，投料時應注意藥材產地、廠家和批次的選擇。主成分分析中S6、S9、S4綜合評分較高，結合主成分分析結果，提示道地藥材在中藥制劑生產中應優先選擇。

銀菊止癢洗液對照指紋圖譜中蛇床子素（15號峰），具有峰面積較大、保留時間適中的特點，且為樣品共有已知成分，故選用15號峰作為參照峰。