灰楸組織培養體系研究

楊玉珍，李曉哲，侯宏偉

（1.南陽農業職業學院植物組織培養中心，河南 南陽 473000；2.中國科學院水生生物研究所，武漢430072）

楸樹（Catalpa bungeiC.A.Mey.）是中國原產樹種，屬于紫葳科（Bignonicaceae）梓樹屬（Catalpa）楸樹組的高大落葉喬木，是較為古老的樹種之一。主要分布在黃河流域、華東及西南等地區［1，2］，是中國珍貴優質的建筑用材和園林觀賞樹種，可營造用材林、楸農間作林、防護林及庭院觀賞、道路綠化等。楸樹樹形挺拔優美、花色艷麗、枝葉繁茂、生長速度快、適應范圍廣、耐寒耐旱、材質名貴，且有很高的藥用價值［3-5］，自古素有“木王”和“黃金樹”之美稱，可與“花王”牡丹相媲美，目前已被中國視為“家珍”進行保護［6，7］。灰楸（Catalpa fargesiiBureau）在河南省南陽市有悠久的栽培歷史，是當地優秀的造林和園林綠化鄉土樹種。近年來，隨著人們生活水平的不斷提高和社會經濟的快速發展，綠化用灰楸苗需求量增大，市場供不應求，如何快速大量地繁殖灰楸良種壯苗已成為當前亟待解決的問題。目前，灰楸的繁殖方式有根蘗繁殖、嫁接繁殖、扦插繁殖、種子繁殖和組培繁殖等。灰楸需異株或異花授粉，結實率、發芽率低，種子繁殖困難［8，9］，且楸樹為難生根樹種，扦插生根率也較低；傳統的埋根繁殖方法，因其繁殖材料相對較少，客觀上限制了繁育的規模；而采用嫁接繁殖的方法時，首先需要培育砧木，目前砧木培育多采用梓樹播種育苗方式，但播種后至少需要2年才能達到嫁接砧木所需的粗度，這種繁殖方式存在砧木培育生產周期長、嫁接技術繁雜的缺點，不利于楸樹的擴繁推廣應用和規模化生產［2，10，11］。組培繁殖則是一種快速擴大優良種質資源的重要手段。

目前，國外對于楸樹組織培養快繁體系的研究鮮有報道，其對楸樹的研究主要側重于楸樹葉綠體基因組的完整測序、無性系生長性狀的遺傳變異及基因型與環境的互作、抗干旱性及抗病蟲害機制等方面［12-16］；國內對楸樹的組織培養雖然有不少報道，但主要集中在周楸、金絲楸、魯楸等種類［17-19］，而灰楸的組織培養快速繁殖體系尚未建立，組培生產過程也鮮見報道。南陽農業職業學院植物組織培養中心對南陽市鄉土樹種灰楸優選株進行了組織培養快速繁殖技術系統的研究。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

以河南省南陽市鄉土樹種灰楸優選株的莖段、新芽為試驗材料，試驗在南陽農業職業學院植物組織培養中心進行。

1.2 試驗方法

1.2.1 外植體的選取和預處理4—6月，將灰楸優選株的當年生莖段剪下，除去葉、葉柄，用洗滌劑浸泡10 min左右，軟毛刷仔細清洗莖段和節芽縫隙，自來水沖洗2 h。

1.2.2 外植體的滅菌與初代培養 超凈工作臺上，紫外照射滅菌15 min，將預處理過的外植體用75%的乙醇溶液滅菌10 s，將0.1%的HgC12溶液倒入燒杯中滅菌16 min，再用無菌水沖洗5次，將莖段橫切成1～2 cm長的小段，接種在不同的固體培養基上。試驗選取MS培養基為基本培養基，2%的蔗糖，0.6%的瓊脂，pH 5.6。以6-BA、GA3和IBA 3種生長調節劑的較低水平進行組合試驗［17-19］，每處理20瓶。接種20 d后觀察側芽培養情況。培養條件：光照度2 500 lx，光照時間12 h/d，溫度（23±1）℃。

1.2.3 繼代培養 腋芽萌發后，自側芽基部切下轉入繼代培養基中，選取6-BA、NAA和IBA 3種生長調節劑進行不同濃度的組合配比試驗［2，11，19］，以MS培養基為基本培養基。觀察叢生芽誘導情況，篩選最佳增殖培養基。叢生芽增殖到一定的數量高度后，轉入最佳增殖培養基。

1.2.4 生根培養 當叢生芽長至3.5～4.5 cm、具3～4片葉時自底部切下，轉入生根培養基內誘導生根［20，21］，每瓶接種5株苗。選擇1/2 MS為基本培養基，以不同濃度的NAA和IBA進行誘導生根試驗，附加0.3%的活性炭，接種30 d后調查幼苗生長情況。

1.2.5 煉苗與移栽 當苗長出3～5片葉，根長到3 cm左右時，移入溫室內馴化，7 d后開蓋煉苗，2 d后將苗取出，用自來水洗凈根部的瓊脂。用小石子和草炭土按體積比1∶3混合，作為栽培基質，苗床底部墊以碎石、碎磚塊。用稀薄的營養液噴霧，每隔7 d噴1次50%多菌靈可濕性粉劑800倍稀釋液，溫度保持在10～25℃。

2 結果與分析

2.1 灰楸愈傷組織與叢生芽的誘導

當側芽萌發后，為了誘導愈傷組織分化叢生芽，將切下的腋芽接種到誘導培養基上，觀察愈傷組織與叢生芽誘導產生情況（表1）、灰楸側芽培養與愈傷組織誘導情況（圖1），篩選出最佳增殖培養基。

從表1可以看出，相同濃度的6-BA下，較高濃度的IBA對形成灰楸側芽生長有明顯促進作用，但對于誘導叢生芽不利。從圖1可以看出，處理1（圖1a）側芽膨大，長出愈傷組織，但無明顯叢生芽；處理2（圖1b）的周圍長出1～2個叢生芽；處理3（圖1c）的側芽周圍長出較多叢生芽；處理5（圖1d）的愈傷組織過大，無健康的叢生芽。結果表明，無菌體系的建立與側芽培養的生長調節劑配比以1.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L GA3+0.5 mg/L IBA為宜，培養20 d左右，側芽周圍有較多叢生芽萌發。無菌體系的建立與側芽的培養僅要求維持成活，促使側芽萌發即可，因此對生長調節劑要求不嚴格，培養基可以選用較低水平的生長調節劑。

圖1 灰楸側芽培養與愈傷組織誘導比較

2.2 灰楸叢生芽繼代增殖培養中生長調節劑配比的選擇

將誘導出的灰楸叢生芽轉移到不同濃度組合的半固體MS培養基中，接種15 d后調查叢生芽誘導生長情況，試驗結果見表2。

從表2可以看出，6-BA濃度在1.0 mg/L以下對叢生芽的誘導作用不明顯，添加IBA后對叢生芽誘導有一定的促進作用，添加NAA對叢生芽誘導沒有明顯的促進作用，最佳生長調節劑是處理6，配比為0.6 mg/L 6-BA+1.0 mg/L IBA。

表2 不同生長調節劑配比對灰楸誘導叢生芽的影響

將需繼代的叢生芽切割后轉入新鮮的增殖培養基中培養。為了增加叢生芽的繁殖速度，叢生芽培養25 d后，將生長較高的叢生芽取出分割成單株、切段，繼續移入附加0.6 mg/L 6-BA+1.0 mg/L IBA的培養基中，進行增殖培養，增殖倍數達4.8左右，25 d左右繼代1次。

灰楸苗的生長情況見圖2。從圖2可以看出，處理2和處理3的叢生芽低矮、生長緩慢；處理8和處理9的叢生芽分別呈現出畸形、分化率低和畸形、葉色黃、分化率高的非健康生長狀態。處理6的叢生芽生長狀況最好，0.6 mg/L 6-BA+1.0 mg/L IBA配比的生長調節劑，較有利于不定芽的分化，芽增殖倍數高、苗健壯、葉色濃綠。

圖2 不同生長調節劑配比下灰楸苗的生長情況

2.3 灰楸生根培養基的選擇

以1/2 MS培養基添加不同濃度和比例的生長調節劑，NAA與IBA對灰楸幼苗生根試驗結果見表3，生根情況見圖3。

從表3、圖3可以看出，添加不同濃度、不同比例的NAA與IBA對楸樹幼苗生根壯苗具有明顯影響，以IBA濃度為0.5 mg/L為最佳。

圖3 不同生長調節劑組合下灰楸生根情況

表3 不同生長調節劑種類和濃度對灰楸生根壯苗的影響

灰楸生根苗移栽后，先置于加蓋遮陽網的大棚中培養，溫度保持在15～25℃，3～4周后將光線提高，逐步撤除遮陽網，空氣相對濕度不低于80%［22］。幼苗健壯、葉色深綠，要防止強光照射。

3 小結

對灰楸優選株從外植體選擇與處理、愈傷組織誘導、不定芽的誘導與增殖，到壯苗生根進行了組培快繁技術的系統研究，并進行了批量生產。研究結果表明，叢生芽誘導增殖最佳生長調節劑配比為MS+1.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L GA3+0.5 mg/L IBA，壯苗培養的最佳生長調節劑配比為MS+0.6 mg/L 6-BA+1.0 mg/L IBA，幼苗生根以1/2 MS+0.5 mg/L IBA為最佳。本研究通過探索誘導叢生芽增殖培養基中的生長調節劑配比、叢生芽繼代增殖培養中生長調節劑的配比以及生根培養基中生長調節劑的配比，篩選得到了最佳快速培養灰楸優選株的繁育技術方法，為實現灰楸的速生豐產、滿足大量生產需求提供了快捷途徑，供行業研究及生產參考，以期加速對中國楸樹資源的開發和利用。