歐月紅寶石冰組織培養快繁技術研究

李 芬，劉木清，祝劍峰

（湖北生態工程職業技術學院，武漢 430200）

月季（Rosa chinensisJacq.）原產于中國，是中國傳統的十大名花之一［1］，素有花中皇后之美稱［2］。17世紀月季被引種傳入歐洲，在歐洲經過了幾百年的繁育，產生了與傳統月季不一樣的特征［3］。歐月泛指2000年以后由歐美、日本等地引進的月季新品種。相較于傳統月季，歐月觀賞性狀更為突出：花色豐富、花瓣數量多、花型多樣獨特、香味多樣而強烈、株型多樣等［4］。歐月應用廣泛，可盆栽、制作切花，也可用作花境和綠籬，深受人們的喜愛，無論從商業還是文化的角度，都是極具潛力的花卉品種［3，4］，在中國的河北、浙江、重慶等地區大量引進種植。

中國月季育苗技術較為落后，生產上仍以傳統的扦插和嫁接方式為主，限制了優良品種育苗的速度，難以滿足市場的需求［1，5］。根據文獻報道，葉貽勛等［6］、于非等［7］先后成功建立了月季組織培養技術體系，歐月品種紅寶石冰屬微型豐花月季，扦插不易生根，嫁接繁殖系數太低，難以進行大規模育苗，因此采用組織培養工廠化育苗是最有效的方法。

1 材料與方法

1.1 供試材料

歐月品種紅寶石冰來自湖北生態工程職業技術學院大冶試驗林場苗圃。

1.2 試驗方法

1.2.1 外植體取材 在4—5月，選擇連續晴朗天氣，生長健壯的紅寶石冰植株，取當年生半木質化的枝條中部作為外植體［8］。將枝條去刺、剝去葉片，用手術刀將每個帶芽莖段切割成長為3 cm左右的外植體，切割時注意芽上部留0.5 cm，下部留2.5 cm。

1.2.2 外植體滅菌 將莖段外植體置于燒杯中，蓋上紗布，自來水流水沖洗30 min，吸干表面水分。先用75%的乙醇滅菌30 s［9］，期間不斷搖動瓶身使乙醇與外植體充分接觸，然后用無菌水沖洗1次，再分別使用0.1% HgCl2和2%NaClO滅菌，最后用無菌水沖洗4～5次待用。其中，0.1% HgCl2滅菌時間設5個處理，分別為4、6、8、10、12 min；2%NaClO滅菌時間設5個處理，分別為7、10、12、15、18 min。滅菌期間每30 s振搖瓶身數次。

1.2.3 初代培養 每個滅菌處理接種30瓶（每配方接種5瓶），每瓶接種2個莖段。7 d后統計污染率，15 d后統計成活率，通過比較不同處理的滅菌效率以確定最佳的滅菌方案。計算公式如下。

采用以上最佳滅菌處理，每個培養基配方接種30瓶，每瓶培養基接種2個莖段，30 d后計算萌發率，通過比較不同配方的萌發率以確定最佳的培養基配方。

1.2.4 繼代增殖培養 腋芽萌發至1～2 cm時即可轉入繼代增殖培養。將腋芽從莖段上切取下來，切割成單芽，注意芽的基部保留一部分莖段組織，有利于形成叢芽。每配方接種30瓶，每瓶接種3個單芽，40 d后計算增殖系數。公式如下。

1.2.5 生根培養 待試管苗高度達3 cm左右即可進行生根培養。將叢芽沿縱向切割成單苗，接種到生根培養基中，每配方接種30瓶，每瓶培養基接種3株，30 d后計算每個配方的生根率。公式如下。

1.2.6 煉苗移栽 待試管苗長出3～4條主根，苗高達4 cm時，即可進行煉苗移栽。移栽前2 d，打開瓶口加入少許水進行煉苗，讓試管苗適應外界的環境。移栽時要洗去根部多余的培養基，防止爛根。移栽后7 d內需進行精細管理，10 d后進行常規水肥管理。栽培基質分別為D1：河沙、D2：河沙+草炭（1∶1）、D3：珍珠巖+草炭+蛭石（1∶1∶1），以上基質比例均為體積比，各基質均需滅菌。每種基質移栽90株，30 d后計算移栽成活率。

1.2.7 培養基及培養條件 以MS為基本培養基［10］，初代培養、繼代增殖培養階段細胞分裂素選用6-BA，生長素選用NAA，采用雙因子試驗設計，各選擇6個配方；生根階段只添加生長素NAA［11］，選擇6個配方。瓊脂7.5 g/L，pH 5.8，蔗糖用量初代培養和繼代增殖培養階段為30 g/L，生根階段為10 g/L。培養溫度為25℃，濕度60%，光照時間為14 h/d，光照度2 500 lx［2］。

2 結果與分析

2.1 不同滅菌劑、不同滅菌時間對紅寶石冰外植體成活率的影響

2%NaClO滅菌效果見表1，0.1%HgCl2滅菌效果見表2。從表1、表2可以看出，在污染率方面，2種滅菌劑表現一致，即隨著滅菌時間的延長，污染率明顯降低。當使用2%NaClO滅菌時間超過18 min后，外植體成活率明顯降低；0.1%HgCl2類似，滅菌時間超過8 min后，雖然污染率有所下降，但外植體成活率也呈明顯下降的趨勢。這與李坤峰等［12］關于滅菌劑在進行外植體表面滅菌時具有兩面性，在殺菌的同時對外植體也會造成一定的傷害的結論一致。使用0.1%HgCl2滅菌最佳的時間為8 min，滅菌效率為75.5%，使用2%NaClO滅菌的最佳時間為18 min，滅菌效率為51.9%。綜合比較，初代培養外植體最佳的滅菌方式是先用75%的乙醇滅菌30 s，然后用0.1%HgCl2滅菌8 min。

表1 2%NaClO對紅寶石冰外植體滅菌效果

表2 0.1%HgCl2對紅寶石冰外植體滅菌效果

2.2 不同培養基配方對紅寶石冰初代培養腋芽萌發的影響

不同培養基配方下紅寶石冰腋芽萌發情況統計見表3。從表3可以看出，不同培養基配方腋芽萌發率的差異較大，當6-BA濃度為0.5 mg/L時，腋芽萌發率非常低，當6-BA濃度高于1 mg/L時腋芽萌發率明顯提高，但當6-BA濃度達到2.5 mg/L和NAA濃度達到0.3 mg/L時，則腋芽萌發率又呈明顯下降，雖然6-BA對腋芽的萌發起促進作用，但并不是6-BA濃度越高腋芽萌發率越高，NAA和6-BA二者的比例影響腋芽萌發率。其中配方A4的萌發率明顯優于其他配方，達到95.1%，因此初代培養最佳培養基配方為MS+0.2 mg/L NAA+2.0 mg/L 6-BA。

表3 不同培養基配方下紅寶石冰腋芽萌發情況

2.3 不同培養基配方對紅寶石冰繼代增殖系數的影響

從表4可以看出，不同培養基配方下增殖系數差別較大，隨著6-BA濃度的增加，增殖系數也隨之增大，證明6-BA能有效地促進不定芽增殖，當NAA濃度超過0.3 mg/L時，雖然6-BA用量在增加，但是增殖系數卻反而降低，因此，NAA僅在一定濃度范圍內對增殖率起促進作用。根據觀察，當NAA濃度過高時，在芽的基部容易產生愈傷組織，反而不利于不定芽的增殖。B3配方增殖系數較其他配方優勢明顯，因此繼代增殖最佳培養基配方為MS+0.2 mg/L NAA+2.5 mg/L 6-BA。

表4 不同培養基配方下紅寶石冰繼代增殖情況

2.4 不同培養基配方對紅寶石冰試管苗生根的影響

紅寶石冰試管苗生根情況見表5。從表5可以看出，隨著培養基中NAA含量的增加，生根率也相應提高，但當NAA濃度達到0.3 mg/L時，生根率反而下降，試管苗基部產生了較大的愈傷組織塊，由此可見，培養基中低濃度的NAA對歐月試管苗生根能起到很好的促進作用。在相同生長調節劑水平下，采用1/2 MS生根率高于MS，因此降低營養元素有利于生根。C4配方生根率比其他配方有明顯優勢，因此試管苗生根階段最佳培養基配方為1/2 MS+0.2 mg/L NAA。

表5 不同培養基配方下紅寶石冰試管苗生根情況

2.5 不同栽培基質對紅寶石冰移栽成活率的影響

不同栽培基質對紅寶石冰移栽情況見表6。表6結果顯示，歐月紅寶石冰在D3珍珠巖+草炭+蛭石的混合基質移栽成活率最高，在D1河沙中，試管苗容易出現爛根，成活率最低。成活的試管苗在不同基質中的生長速度不同，在D3中生長速度最快，D2草炭+河沙次之，在D1中生長最慢，因此D3珍珠巖+草炭+蛭石（1∶1∶1）混合基質最有利于試管苗的移栽成活。

表6 不同栽培基質下紅寶石冰移栽成活情況

3 小結與討論

以歐月品種紅寶石冰為試驗材料，取其半木質化的中部莖段作為外植體，研究了2種滅菌劑、不同滅菌時間對外植體污染率和成活率的影響，不同生長調節劑水平對腋芽萌發、繼代增殖、試管苗生根的影響，3種不同移栽基質對試管苗移栽成活率的影響，成功建立了組織培養技術體系，并篩選出了最佳的滅菌方法、組培各階段最佳的培養基配方以及移栽的最佳基質。

結果表明，采用0.1% HgCl2滅菌8 min效果最佳，與袁婉君等［13］研究結果一致，該配方不僅能對外植體表面附著的微生物進行有效殺滅，且對外植體材料損傷較小，少有外植體因滅菌發生褐變死亡。初代培養階段最佳培養基配方為MS+0.2 mg/L NAA+2.0 mg/L 6-BA，腋芽萌發率為95.1%；繼代培養階段最佳培養基配方為MS+0.2 mg/L NAA+2.5 mg/L 6-BA，增殖系數為4.09；生根培養階段最佳培養基配方為1/2 MS+0.2 mg/L NAA，生根率為85.6%；移栽最佳基質為珍珠巖+草炭+蛭石（1∶1∶1），移栽成活率為91.1%。目前，月季組織培養研究較多，但歐月組織培養育苗研究報道較少，本研究成功建立了歐月品種紅寶石冰的組織培養技術體系，為其大規模育苗提供了技術支撐，也為歐月其他品種的組織培養育苗技術的建立提供了參考。

外植體滅菌方面，目前已發表的相關研究大多只選用了一種滅菌劑［14-17］，本研究在歐月外植體滅菌方面選用了2%NaClO、0.1% HgCl22種滅菌劑進行對比試驗，擴大了滅菌劑的選擇范圍。在確定最佳滅菌方案時，以滅菌效率為最終的評判指標，即綜合比較污染率和成活率2個因素，更有利于篩選最佳的滅菌方案。

關于細胞分裂素對腋芽萌發的影響，本研究結果與葉貽勛等［18］的研究結果一致，即6-BA在一定濃度范圍內能起到促進作用，但當6-BA用量過大時反而不利于腋芽萌發，李坤峰等［12］認為6-BA用量過大還會導致試管苗玻璃化，本研究也發現在增殖階段當6-BA達到3.0 mg/L時，確實有少數瓶苗出現了不同程度的玻璃化現象。關于腋芽著生的位置對叢生芽增殖的影響，鄭萍等［19］認為枝條中間部位的最佳，本研究發現枝條不同部位的腋芽在誘導叢生芽時并無明顯差別，可能與外植體取材有關，研究材料為半木質化帶芽莖段，陳蘭芬［8］也認為最適宜作為微型月季的外植體材料為半木質化帶芽莖。關于移栽基質方面，本研究發現珍珠巖+草炭+蛭石（1∶1∶1）最有利于移栽成活，且在該基質中組培苗生長最快，因此混合基質有利于移栽，與劉子平等［14］研究結論一致。

關于培養條件，本研究在各個階段都采用同樣的溫度、光照度、光照時間等。腋芽萌發階段光照度的問題，有研究曾報道月季在萌芽階段適當給予弱光培養會促進月季腋芽萌發［20］，本研究并未采用先弱光、后正常光照度交替試驗，下一步需要做光照對比試驗，進一步優化培養條件。關于生長調節劑選擇方面，本試驗與前人的報道類似，腋芽增殖方式選擇6-BA和NAA進行配比［1，21-24］，對KT、IAA等生長調節劑研究較少，下一步需要擴大生長調節劑的選擇范圍，進一步優化培養基配方。關于移栽成活后歐月組培苗的生長情況，本試驗未做研究，需要進一步進行栽培試驗，研究試管苗與常規嫁接苗在生長勢、觀賞性狀和抗性方面的差異性。