益氣祛痰解毒方通過調控FRMD6 抑制非小細胞肺癌進展的作用機制研究

姚 成 陳 冬 陳濱海 高文倉

肺癌是全球發病率和死亡率最高的惡性腫瘤之一，其中非小細胞肺癌（NSCLC）約占85%且中晚期患者生存率極低[1]。中藥具有豐富的生物活性，通過多途徑和多靶點在腫瘤治療中發揮作用[2]。益氣祛痰解毒方以澤漆湯為主，具有益氣祛痰、解毒散結的功效，臨床上用于肺癌治療且具有抗表皮生長因子受體（EGFR）-酪氨酸激酶抑制劑（TKIs）耐藥性[3]，但是其在NSCLC 中的作用機制尚不清楚。本文旨在研究益氣祛痰解毒方與FERM 結構域蛋白6（FRMD6）在NSCLC 中的分子調控機制，報道如下。

1 實驗材料

1.1 細胞株和試劑 PC9 細胞株購自美國ATCC（批號CRL-5908）；中藥材由浙江中醫藥大學附屬第二醫院中藥房提供；RPMI1640 培養基（批號A4192301）、胎牛血清（批號12664025）、青霉素和鏈霉素（批號15070063）等購于美國Gibco 公司；空白對照載體（shNC）和FRMD6 干擾載體（shFRMD6）及慢病毒包裝質粒購自上海吉瑪基因公司；CCK-8 試劑盒（批號C0037）、Trizol 試劑盒（批號R0016）、逆轉錄試劑盒（批號D7168S）、Annexin V-FITC/PI 檢測試劑盒（批號C1062M）和BCA 試劑盒（批號P0012S）購于上海碧云天生物技術有限公司；FRMD6（批號PA5-51553）和肝細胞生長因子受體基因（c-Met）（批號37-0100）購自美國ThermoFisher 公司；磷酸化PI3K（p-PI3K）（批號17366）、磷酸肌醇-3-激酶（PI3K）（批號4249）、磷酸化Akt（p-Akt）（批號13038）、蛋白激酶B（Akt）（批號9272）、β 肌動蛋白（β-actin）（批號4970）和IgG/HRP（批號7074）購自美國Cell Signaling Technology 公司。

1.2 主要儀器 酶標儀（型號：680）、實時熒光定量PCR 儀（型號：9600）和電泳儀（型號：1658001）購自美國Bio-Rad 公司；流式細胞儀（型號：FACSCalibur）購自美國BD 公司。

2 實驗方法

2.1 益氣祛痰解毒方制備 益氣祛痰解毒方：澤漆、石見穿各30 g，前胡10 g，人參、桂枝、黃芩、半夏各9 g，紅豆杉8 g，蜂房15 g，生姜5 g。制備益氣祛痰解毒方提取物干粉并配置成1 mg/mL 的藥液，儲存于4 ℃冰箱中備用。

2.2 細胞培養、慢病毒轉染及分組 PC9 細胞用含10%胎牛血清、100 U/mL 青霉素和鏈霉素的RPMI1640 培養基在37 ℃、5% CO2的細胞培養箱中培養。取指數生長期的PC9 細胞，空白對照載體和shFRMD6 的RNA 干擾慢病毒液感染PC9 細胞，構建空白對照載體組PC9 細胞株（shNC）和FRMD6 敲低PC9 細胞株（shFRMD6）。分組：對照組、益氣祛痰解毒方組、shNC 組、shFRMD6 組、益氣祛痰解毒方+shNC 組、益氣祛痰解毒方+shFRMD6 組。

2.3 細胞增殖實驗 參考CCK-8 試劑盒說明書檢測細胞增殖，細胞（1×103個/孔）接種于96 孔板，在37 ℃、5% CO2中培養，24 h 后加入CCK-8 溶液，再培養4 h 后利用酶標儀檢測450 nm 處各組OD 值。細胞活性（%）=（實驗組OD 值/對照組OD 值）×100%。

2.4 實時定量PCR 檢測 根據Trizol 試劑盒說明提取總RNA，按照逆轉錄試劑盒說明合成cDNA，采用實時定量PCR 儀檢測，反應條件為93 ℃10 min、95 ℃30 s、60 ℃1 min、72 ℃1 min，共40 個循環。以GAPDH 為內參，采用2-ΔΔCT法計算FRMD6 相對表達水平。引物由上海生工生物工程有限公司合成，引物序列如下：FRMD6 正向：5'-CTTCCCAACGATGAATCTCTGAA-3'，反向：5'-GGCAGTCCTTTAGCCTGAGC-3'；GAPDH 正向：5'-AAGAAGGTGGTGAAGCAG-3'，反向：5'-GAAGGTGGAAGAGTGGGAGT-3'。

2.5 Western blot 檢測 PC9 細胞于6 孔板培養24 h，經沖洗、RIPA 裂解后提取總蛋白質，利用BCA 試劑盒測定蛋白濃度。取20 μg 于緩沖液中，經電泳分離后轉移至PDVF 膜上，5%脫脂奶粉封閉2 h 后，按1∶1000 加入一抗（FRMD6、c-Met、p-PI3K、PI3K、p-Akt、Akt 和β-actin）4 ℃孵育過夜。后加入二抗（IgG/HRP，1∶2000）室溫反應2 h 并獲取顯影蛋白條帶。

2.6 細胞侵襲實驗 制備濃度為2×105/mL 的細胞懸液，Transwell 小室的上層膜表面均勻鋪上基質膠，取200 μL/孔的PC9 細胞懸液加入上層，向下層中加入600 μL/孔的完全培養基（含20%血清），于37 ℃、5% CO2細胞培養箱中培養24 h，用0.1%結晶紫染液對下層細胞進行染色，置于顯微鏡下觀察拍照收集圖像。

2.7 細胞凋亡檢測 根據Annexin V-FITC/PI 檢測試劑盒說明檢測各組細胞凋亡，將PC9 細胞加入5 μL Annexin V-/FITC 后避光反應20 min，然后加入5 μL PI 避光反應20 min，利用流式細胞儀檢測PC9 細胞凋亡情況。

2.8 統計學方法 所有數據利用GraphPad Prism 8.0 軟件處理，符合正態分布的計量資料以均數±標準差（）表示，兩組間均數比較，采用t 檢驗，多組間均數比較，采用單因素方差分析，以P＜0.05 為差異有統計學意義。

3 實驗結果

3.1 益氣祛痰解毒方上調FRMD6 表達水平 研究表明，FRMD6 有抑制腫瘤的作用[4]。CCK-8 檢測發現，益氣祛痰解毒方顯著抑制PC9 細胞增殖（P＜0.05）（見表1），進一步qRT-PCR 檢測顯示，與對照組比較，益氣祛痰解毒方組的FRMD6 表達水平顯著升高（P＜0.01）（見表2）。同時，Western blot 檢測結果與qRT-PCR 結果一致，見圖1。

表1 PC9 細胞增殖率（%，）

表1 PC9 細胞增殖率（%，）

注：對照組為正常培養的PC9 細胞；益氣祛痰解毒方組為用益氣祛痰解毒方（1 mg/mL）處理的PC9 細胞；與對照組比較，aP＜0.05

表2 PC9 細胞FRMD6 表達水平（）

表2 PC9 細胞FRMD6 表達水平（）

注：對照組為正常培養的PC9 細胞；益氣祛痰解毒方組為用益氣祛痰解毒方（1 mg/mL）處理的PC9 細胞；FRMD6 為FERM 結構域蛋白6；與對照組比較，aP＜0.01

圖1 Western blot 檢測PC9 細胞FRMD6 蛋白表達

3.2 益氣祛痰解毒方通過上調FRMD6 抑制PC9 細胞增殖和促進凋亡 FRMD6 參與腫瘤細胞增殖和凋亡的調控[5]。本實驗利用慢病毒感染構建FRMD6敲低PC9 細胞株，qRT-PCR 顯示，與對照組比較，shFRMD6 組FRMD6 表達顯著降低（P＜0.05）（見表3）。同時，Western blot 檢測結果一致，見圖2A。

表3 PC9 細胞FRMD6 表達水平（）

表3 PC9 細胞FRMD6 表達水平（）

注：對照組為正常培養的PC9 細胞；shNC 組為轉染空白對照載體的PC9 細胞；shFRMD6 組為轉染FRMD6 敲低質粒的PC9 細胞株；FRMD6 為FERM 結構域蛋白6；與對照組比較，aP＜0.05

CCK-8 檢測發現，與shNC 組比較，益氣祛痰解毒方+shNC 組PC9 細胞增殖率顯著降低（P＜0.05），而shFRMD6 組PC9 細胞增殖率升高（P＜0.01）。此外，與益氣祛痰解毒方+shNC 組比較，益氣祛痰解毒方+shFRMD6 組PC9 細胞增殖率顯著上升（P＜0.01）（見表4）。Annexin V-FITC/PI 顯示，與shNC 組比較，益氣祛痰解毒方顯著抑制PC9 細胞凋亡，并且敲低FRMD6 會顯著減弱益氣祛痰解毒方對PC9 細胞凋亡的作用，見圖2B。

表4 各組PC9 細胞增殖率比較（%，）

表4 各組PC9 細胞增殖率比較（%，）

注：shNC 組為轉染空白對照載體的PC9 細胞；shFRMD6 組為轉染FRMD6 敲低的PC9 細胞株；益氣祛痰解毒方+shNC 組為用益氣祛痰解毒方（1 mg/mL）處理的轉染空白對照載體的PC9 細胞；益氣祛痰解毒方+shFRMD6 組為用益氣祛痰解毒方（1 mg/mL）處理的轉染FRMD6 敲低質粒的PC9 細胞株；FRMD6 為FERM 結構域蛋白6；與對照組比較，aP＜0.05，bP＜0.01；與益氣祛痰解毒方+shNC 組比較，cP＜0.01

3.3 益氣祛痰解毒方抑制PC9 細胞侵襲 Transwell顯示，與shNC 組相比，益氣祛痰解毒方+shNC 組顯著抑制PC9 細胞侵襲，而shFRMD6 組則促進PC9細胞侵襲。此外，與益氣祛痰解毒方+shNC 組比較，益氣祛痰解毒方+shFRMD6 組PC9 細胞侵襲增強，見圖2C。

圖2 Western blot 檢測PC9 細胞FRMD6 蛋白表達（A）；各組PC9 細胞凋亡（B）和侵襲（C）比較

3.4 益氣祛痰解毒方通過調控FRMD6 表達來抑制c-Met/PI3K/Akt 通路 c-Met/PI3K/Akt 通路與NSCLC細胞功能調控密切相關[6]。Western blot 檢測顯示，與shNC 組比較，益氣祛痰解毒方+shNC 組c-Met、p-PI3K 和p-Akt 表達顯著下調；而shFRMD6 組上調c-Met、p-PI3K 和p-Akt 表達，這表明下調FRMD6表達能夠激活c-Met/PI3K/Akt 通路。與益氣祛痰解毒方+shNC 組比較，益氣祛痰解毒方+shFRMD6 組c-Met、p-PI3K 和p-Akt 表達顯著上調，表明敲低FRMD6 會影響益氣祛痰解毒方對c-Met/PI3K/Akt通路的抑制作用，見圖3。

圖3 c-Met/PI3K/Akt 通路的蛋白表達

4 討論

NSCLC 是臨床上常見的惡性腫瘤[7]。中藥已廣泛用于腫瘤的治療且在預防腫瘤轉移和耐藥中表現出積極作用[8]。研究表明，長期服用吉非替尼會產生較強的耐藥性，不利于NSCLC 患者的治療[9]。NSCLC 患者存在c-Met 過度激活進而導致腫瘤細胞惡性發展的情況，同時c-Met 通路的異常激活是NSCLC 耐藥的機制之一[10]。已有研究表明，益氣祛痰解毒方可以通過調節PI3K/Akt/mTOR 通路來抑制NSCLC 發展[11]。

研究表明，中藥與癌癥的信號通路和分子靶點具有密切關系[8]。FRMD6 為一種新型腫瘤抑制因子，是調節細胞生長和分化的上游通路調控蛋白，調控FRMD6 可抑制肝細胞癌和前列腺癌等癌癥的發展[4]。本文研究發現，益氣祛痰解毒方能夠上調FRMD6 的表達，而敲低FRMD6 會影響益氣祛痰解毒方對PC9細胞的抑制效果。此外，研究發現推動NSCLC 發展的部分原因與c-Met 擴增有關，c-Met 通過激活下游信號通路促進NSCLC 細胞增殖和轉移[12]。FRMD6 可通過下調c-Met 蛋白表達來癌細胞發展[5]。本研究結果表明，益氣祛痰解毒方通過調控FRMD6 表達從而抑制c-Met/PI3K/Akt 通路。

綜上所述，益氣祛痰解毒方在抑制NSCLC 發展方面作用顯著。同時，益氣祛痰解毒方能夠抑制NSCLC 的PC9 細胞增殖、侵襲和促進細胞凋亡，其分子機制是調控FRMD6 表達進而抑制c-Met/PI3K/Akt 通路。